温度可控的电化学汞离子传感器及其制备方法与流程

文档序号:11175676阅读:561来源:国知局
温度可控的电化学汞离子传感器及其制备方法与流程

本发明属于生物分析技术领域,具体涉及一种温度可控的电化学汞离子传感器及其制备方法,应用于核酸检测领域。



背景技术:

重金属离子hg2+等由于它们的性质相对比较稳定,在自然环境中很难被生物降解,且具有很强的生物毒性,会通过食物链的富集最终残留在人体内,并破坏人体的各种生理功能,最终对人体的组织器官甚至于生命构成严重威胁。因此,对汞离子建立快速、可靠的检测方法的研究,在环境监测与食品安全检测等方面具有非常重要的意义。

传统的重金属离子检测方法主要是依赖于大型的专业仪器,这些方法主要缺点是成本高且使用维护要求高等。因此相比之下,电化学分析技术是通过导线来感测待测物质信号的,具有仪器设备简单、操作方便易自动化、便于携带等优点,且其兼备灵敏度和准确度较高、选择性好等优点,因此常用于金属离子检测。2004年ono小组首次提出“t-hg2+-t”结构,即hg2+能够与t-t错配碱基对特异性结合,形成“t-hg2+-t”稳定的结构。将t-t作为hg2+特异性识别基团,从而可以构建出多种的hg2+传感分析方法。由于很低浓度的hg2+就会对人体的健康造成严重损害,因此高灵敏度和高准确性一直是分析检测方法的改进目标。针对这一需求,一种简单、快速的基于外切酶iii的信号放大方法被广泛运用于各种分子离子的高灵敏检测。

外切酶ⅲ是一种对温度变化十分敏感的生物大分子,温度低于最适温度时酶的活性较差,但过高的温度极易使酶分子结构发生不可逆转的变性导致酶失活。以往报道的电流型生物传感器,大多控制实验体系的整体温度变化,所需装置复杂,操作不易;在热电极表面构建生物传感器,可以只改变电极表面温度使酶处于最适条件而不对溶液进行整体加热,又增强了溶液对流,提高了传质速率,可缩短传感器到达稳态电流的时间,并增大电极响应信号。



技术实现要素:

本发明目的在于提供一种温度可控的电化学汞离子传感器及其制备方法。本发明利用双链dna序列中的特殊碱基对t-t错配能够与hg2+特异性结合,再利用外切酶iii的切割作用释放hg2+,实现对hg2+的高灵敏分析检测;本发明的传感器结构简单、检测时间短、灵敏度高、选择性好,为环境监测与食品安全等方面提供了一种快速、低成本检测hg2+的方法。

为了实现本发明目的,本发明采用如下技术方案:

一组用于温度可控的电化学汞离子传感器的信号探针,信号探针p1与辅助探针p2互补存在可以识别hg2+的t-t错配结构,其核苷酸序列如下:

信号探针p1:5’-sh-(ch2)6-ccccat(fc)cgccaccagcttct-3’,

辅助探针p2:5’-tgtagctggtggcgatcccac-3’;

其中,信号探针p1的近5’标记了二茂铁(fc)且其5’端有巯基化修饰。

一种温度可控的电化学汞离子传感器,该传感器是基于外切酶iii目标循环信号放大的电化学hg2+传感器,其组成成分包括金盘热电极、信号探针p1、辅助探针p2和核酸外切酶iii。

其制备方法包括以下步骤:

(1)设计并合成信号探针p1和辅助探针p2;

(2)将金盘热电极打磨抛光成镜面,经二次蒸馏水超声清洗,干燥,得处理后的金盘热电极;

(3)将含有信号探针p1的缓冲溶液滴加在步骤(2)中处理好的金盘热电极上,再用巯基己醇对电极表面残余位点进行封闭,得到信号探针p1修饰的金盘热电极;

(4)将步骤(3)中得到的电极浸泡在含有辅助探针p2、外切酶iii和不同浓度hg2+混合缓冲液溶液中进行杂交酶切循环,反应结束后得到电化学hg2+传感器。

其中,所述步骤(2)中,打磨采用在麂皮上用氧化铝粉末打磨;超声清洗的时间为20~60s,干燥方式为氮气吹干。

步骤(3)中,所述缓冲液为含有10~20mmtris-hcl,90~110mmnacl,9~11mm三(2-羧乙基)膦的混合液,其ph为7.2~7.6。

步骤(3)中,p1的浓度为1~2μm;修饰温度为20~25℃;修饰时间为1.5~2.5h;巯基己醇浓度为0.1~4mm。

步骤(4)中,所述缓冲液为含有10~20mmtris-hcl,400~600mmnacl,9~11mmmgcl2的混合液,其ph为7.2~7.6。

步骤(4)中,p2的浓度为1~2μm,外切酶iii浓度为1~5μ/μl,杂交酶切循环反应温度为0~40℃,反应时间为0.25~2h。

步骤(4)中,通过外加直流电流调控金盘热电极温度,来控制杂交酶切循环反应过程温度。

本发明的另一目的在于提供一种上述温度可控的电化学传感器在检测hg2+中的应用,检测步骤如下:

(1)将步骤(3)中得到的信号探针修饰的金盘热电极在10mmtris-hcl检测液与银氯化银参与电极和铂丝对比电极构成三电极系统,运用方波伏安法(swv)进行检测,得到二茂铁的氧化电流i0(fc);

(2)将权利要求1所述步骤(4)中最终得到的电化学生物传感器用swv在10mmtris-hcl检测液中检测,得到二茂铁的氧化电流(ifc),然后与步骤(1)得到的i0(fc)做差取绝对值得:|δifc|=|ifc-i0(fc)|;以|δifc|对hg2+浓度对数做线性回归方程,得工作曲线。

本发明相对于现有技术具有如下有益效果:

(1)本发明在设计单链信号探针过程中,将二茂铁标记在靠近巯基化5’的位置,拉近二茂铁与电极表面的距离,大大提高了电极表面二茂铁的电化学信号,同时代替了复杂的发卡结构信标分子;

(2)本发明利用hg2+能够与t-t错配碱基对特异性结合,形成“t-hg2+-t”稳定的结构,提高了电化学hg2+传感器的选择性及其在实际样品中的实用性。

(3)本发明将外切酶iii目标循环信号放大技术应用到hg2+的检测中来,在实现高灵敏地对hg2+进行检测(检测限达到6.1pm)的同时还具有操作简便,低成本,检测快速等优点。

(4)本发明在金盘热电极表面构建生物传感器,可以只改变电极表面温度使外切酶iii处于最适条件而不对溶液进行整体加热,增强了溶液对流,提高了传质速率,增强了外切酶iii活性,促进了酶切反应的进行,并增大电极响应信号,提高检测灵敏度。

附图说明

图1本发明一种温度可控的电化学hg2+传感器的制备过程示意图。

图2实验优化条件图,杂交酶切循环过程反应时间。

图3实验优化条件图,杂交酶切循环过程电极温度。

图4本发明电化学hg2+传感器对不同浓度的hg2+的电化学响应。

图5本发明电化学hg2+传感器对其他不同金属离子的电化学响应。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,本领域技术人员将会理解,以下实施例仅为本发明的优选实施例,以便更好地理解本发明,因而不应视为限定本发明的范围。

实施例1

一种温度可控的基于外切酶iii目标循环信号放大的电化学hg2+传感器的制备方法,如图1所示,包括以下步骤:

(1)设计一条靠近5’标记了二茂铁(fc)的信号探针p1,所述信号探针p1与dna辅助探针p2的互补存在可以识别hg2+的t-t错配结构,在hg2+存在下,p2与p1进行杂交,形成带有t-hg2+-t结构的具有3’平端的双链结构。诱导核酸外切酶iii对p1进行消解,hg2+被释放循环利用;p1链的5’端巯基化;

其中,信号探针p1的核苷酸序列为:5’-sh-(ch2)6-ccccat(fc)cgccaccagcttct-3’,

辅助探针p2的核苷酸序列为:5’-tgtagctggtggcgatcccac-3’;

(2)金盘热电极在麂皮上用0.05mmal2o3打磨成镜面,用二次蒸馏水超声清洗40~60s;之后再0.5m硫酸溶液中循环伏安,扫速0.1v/s至稳定后二次水冲洗干净,氮气吹干;

(3)将信号探针p1溶于ph为7.4的含有10mmtris-hcl,100mmnacl,10mm三(2-羧乙基)膦的缓冲液中使其终浓度为1mm,处理2小时打开二硫键;后将3ml其溶液滴加在步骤(2)中处理好的金盘热电极上,在25℃下修饰时间2h;再用浓度为2mm巯基己醇对电极表面残余位点进行封闭,封闭时间为1h,得到信号探针p1修饰的金盘热电极;

(4)将2mmp2、2μ/μl外切酶iii和一定浓度hg2+的混合在ph为7.4的含有10mmtris-hcl,500mmnacl,10mmmgcl2的缓冲液中,将步骤(2)中得到的电极浸泡在此缓冲液中进行杂交酶切循环,在40℃下反应1h,反应温度是通过外加直流电流调控金盘热电极温度来控制,反应结束后得到电化学hg2+传感器。

实施例2

反应时间优化实验:

变实施例1步骤(4)中的酶切循环反应时间依次为0,15,30,45,60,75,90,105,120min.分别在不同电极温度(0ºc,25ºc,40ºc)下进行实验,其他反应条件同实施例1;将实施例1步骤(3)中得到的巯基化信号探针p1修饰的金盘热电极在10mmtris-hcl检测液中进行swv检测,得到fc的氧化峰电流i0(fc);将实施例1步骤(4)中最终得到的电化学生物传感器用swv在10mmtris-hcl检测液中检测,将得到的fc的氧化峰电流ifc与得到的i0(fc)做差取绝对值得:|δifc|=|ifc-i0(fc)|;以|δifc|对温度作图,如图2所示,在同一电极温度下可以看出随反应时间的持续|δifc|变大,最终达到一个稳定值。而在不同的酶切循环反应温度下,温度越高所达到的平衡程度更完全更彻底,这些结果也初步说明了温度升高提高了exoiii的活性,并促进酶切循环的进行,缩短反应时间。从实验反应的高效性和灵敏度考虑,选择酶切循环反应时间为60min作为检测hg2+的反应时间。

实施例3

反应温度优化实验:

只改变实施例1步骤(4)中的反应温度,其中a为对照组,b-f的反应温度依次为0,10,20,24,30,35,40ºc,分别进行实验,其他反应条件同时实施例1;将实施例1步骤(3)中得到的信号探针p1修饰的金盘热电极在10mmtris-hcl检测液中进行swv检测,得到fc的氧化峰电流i0(fc);将实施例1步骤(4)中最终得到的电化学生物传感器用swv在10mmtris-hcl检测液中检测,将得到的fc的氧化峰电流与得到的i0(fc)做差取绝对值得:|δifc|=|ifc-i0(fc)|;以|δifc|对温度作图,如图3所示,可以看出随温度升高|δifc|变大,说明温度升高可以增加exoiii的活性,促使酶切反应更快的进行。最终选用40ºc为最佳酶切循环反应温度。

实施例4

为本发明电化学hg2+传感器对hg2+的电化学灵敏度检测:

采用本发明所述的电化学hg2+传感器,标记了二茂铁的信号探针p1(序列:5’-sh-(ch2)6-ccccat(fc)cgccaccagcttct-3’)作为信号探针,以与p1存在可以识别hg2+的t-t错配的p2(序列:5’-tgtagctggtggcgatcccac-3’)作为辅助探针。所有操作步骤均如同上述实施例1,其中,通过改变hg2+的浓度,检测本发明电化学hg2+传感器的电化学响应特性。

其检测过程为:将实施例1步骤(3)中得到的信号探针p1修饰的金盘热电极在10mmtris-hcl检测液进行swv检测,得到二茂铁的氧化电流i0(fc);将实施例1步骤(4)中最终得到的电化学生物传感器用swv在10mmtris-hcl检测液中检测,将得到的二茂铁的氧化电流与得到的i0(fc)做差取绝对值得:|δifc|=|ifc-i0(fc)|;以|δifc|对tp浓度对数做线性回归方程,得工作曲线。

其检测结果如图4所示,在杂交酶切循环过程在0℃下进行时,所检测的hg2+浓度从a到f依次为0m,5nm,10nm,20nm,50nm,100nm,|δifc|与hg2+浓度在5.0nm~100.0nm呈线性,检测限为0.7nm(s/n=3);在杂交酶切循环过程在25℃下进行时,所检测的hg2+浓度从a到g依次为0m,100pm,500pm,1nm,5nm,10nm,100nm,|δifc|与hg2+浓度在100.0pm~100.0nm呈线性,检测限为22.0pm(s/n=3);当在杂交酶切循环过程在40℃下进行时,所检测的hg2+浓度从a到i依次为0m,10pm,50pm,100pm,500pm,1nm,10nm,100nm,|δifc|与hg2+浓度在10.0pm~100.0nm范围内呈线性关系,检测限为6.1pm(s/n=3),相比于0℃时,其检测限降低了2个数量级,相比于25℃时,其检测限降低了1个数量级,表明升高温度,酶切活性性增强,实现了对hg2+高灵敏的检测。

实施例5

为本发明电化学hg2+传感器对其他不同金属离子电化学响应:

采用本发明所述方法,选取了其他多种常见的金属离子如:ag+、cd3+、pb2+、co2+、cu2+、fe3+、ni2+、zn2+、mg2+进行了选择性实验。用于实验的hg2+浓度为100nm,其他离子均为10µm。每种离子在参与酶切循环反应的条件都是在电极温度为40ºc下反应1h。实验结果如图5所示,分别在其他离子存在条件下制备的传感器的swv峰电流im较实施例1步骤(3)中得到的i0(fc)没有明显变化;而在hg2+存在条件下制备的传感器的swv曲线ihg2+较实施例1步骤(3)中得到的i0(fc)明显下降。实验结果表明基于t-hg2+-t的特异性结合作用,本试验方法对hg2+的检测相对于其他金属离子有很好的选择性。

实施例6

为本发明电化学hg2+传感器水样加标回收率检测:

采用本发明所述方法,运用标准加入法,在自来水样中加入3种不同浓度的hg2+标液,酶切循环反应在电极温度为40ºc下反应1h实验条件下,对水样进行了回收率测定,实验结果如表1所示,回收率范围为99.0~100.8%,说明本试验设计的hg2+传感器能够准确检测水样的hg2+含量。

表1不同浓度的水样加标回收率表

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<110>福州大学

<120>温度可控的电化学汞离子传感器及其制备方法

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