麝香壮骨膏标准特征图谱的构建及其质量检测方法与流程

本发明涉及中成药的质量控制技术，具体涉及一种麝香壮骨膏的标准特征图谱的构建及其质量检测方法。

背景技术：

麝香壮骨膏是一种上市多年的中成药，现行执行标准是国家药品标准ws3-b-2268-96。麝香壮骨膏是由八角茴香、山柰、生川乌、生草乌、麻黄、苍术、白芷、当归、干姜、人工麝香、薄荷脑、水杨酸甲酯、硫酸软骨素、冰片、盐酸苯海拉明、樟脑等十六味原料组成，具有镇痛、消炎之功效，可用于风湿、关节痛，腰痛，神经痛，肌肉酸痛和扭挫伤。

麝香壮骨膏作为中成药，其药效是多种活性成分共同作用的结果。但目前麝香壮骨膏的质量控制方法为仅检测单一指标成分的含量，如中国发明专利申请公开号cn101991839a、cn200610036947.3、cn200610036858.9、cn200510046400.7、cn201410170043.4和名称为“八角茴香水溶性成分hplc指纹图谱及莽草酸的定量研究”、“草乌药材hplc指纹图谱研究”、“川乌hplc指纹图谱研究”等专利和文献均只涉及部分药材指纹图谱的检测方法，而名称为“hplc法测定麝香壮骨膏药材浸膏中欧前胡素的含量”测定的则是药材浸膏中欧前胡素的含量，另有名称为“rp－hplc法测定麝香壮骨膏中盐酸苯海拉明的含量”和“气相法测定麝香壮骨膏中樟脑、薄荷脑、冰片、水杨酸甲酯含量”的文献研究中只涉及到麝香壮骨膏中樟脑、薄荷脑、冰片、水杨酸甲酯和盐酸苯海拉明含量的测定，因此，现有技术中的检测方法未能对其他有效成分，如八角茴香、山柰、生川乌、生草乌、麻黄、苍术、当归、干姜进行检测，因此存在一定的局限性，无法全面反映产品质量状况。

技术实现要素：

本发明的首要目的是提供一种操作方便、重现性好、精密度高的麝香壮骨膏的标准特征图谱的构建方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种麝香壮骨膏标准特征图谱的构建方法，步骤如下：

a)标样溶液、参照物溶液的准备：将至少15批次合格的麝香壮骨膏分别回流提取得到各标样溶液，将盐酸苯海拉明对照品加甲醇制成参照物溶液；

b)高效液相色谱分析：精密吸取等量的各标样溶液、参照物溶液，分别注入液相色谱仪进行测定，即得各标样溶液和参照物溶液的色谱图；

c)标准特征图谱的构建：将得到的各标样溶液的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，制定得到麝香壮骨膏的标准特征图谱，该标准特征图谱中有17个特征峰，按出现的时间顺序将所述的17个特征峰依次编号1～16、s，以参照物溶液的色谱峰的相对保留时间为1，计算得知1～16号特征峰的平均相对保留时间分别为0.10、0.15、0.19、0.21、0.22、0.34、0.36、0.37、0.46、0.57、0.64、0.72、0.76、0.89、0.90、0.92；所述的s号色谱峰是盐酸苯海拉明的特征峰，其平均相对保留时间为1。

本发明公开的麝香壮骨膏的标准特征图谱的构建方法是申请人经多年的试验研究获得，不仅能反映麝香壮骨膏的内在质量，而且操作简便快捷。采用本发明公开的上述方法构建的标准特征图谱中的17个特征峰的分离度高，从而为后续麝香壮骨膏产品的质量检测有效地提供了数据基础，进而为麝香壮骨膏今后的标准化生产提供一种可行的质量控制模式。具体说来，本发明是将合格的各麝香壮骨膏制得的标样溶液与对盐酸苯海拉明照品制得的参照物溶液在规定的实验条件下测定分析得到色谱图，这样将盐酸苯海拉明对照品的色谱图与合格的各麝香壮骨膏的色谱图进行比对，从而可以确定两者之间的共有特征峰，亦即找出各麝香壮骨膏测得的色谱图上的盐酸苯海拉明的特征峰，从而以盐酸苯海拉明特征峰的相对保留时间为1，计算出各麝香壮骨膏的色谱图上其他特征峰的相对保留时间，进而为后续的待测麝香壮骨膏产品的质量检测提供数据基础。

需要说明的是，所述的合格的麝香壮骨膏也可以理解为是标准麝香壮骨膏，其是质量完全符合国家相关标准的麝香壮骨膏。

本发明的另一个目的是基于以上方法构建的麝香壮骨膏的标准特征图谱，提供一种麝香壮骨膏的质量检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种麝香壮骨膏的质量检测方法，步骤如下：按照标样溶液和参照物溶液的方法制备并测定得到待测麝香壮骨膏的色谱图和盐酸苯海拉明对照品的色谱图，将待测麝香壮骨膏的色谱图与构建的标准特征图谱比对，若待测麝香壮骨膏的色谱图中出现标准特征图谱中相同的17个特征峰，与参照物峰相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，各特征峰的相对保留时间与标准特征图谱中各特征峰的相对保留时间的相对标准偏差在±5％以内，则该麝香壮骨膏的质量合格，反之则不合格，如此可以实现快速检测判断麝香壮骨膏的质量。

附图说明

图1-12为实施例1测得的色谱图；

图13实施例2测得的盐酸苯海拉明的色谱图；

图14为实施例2测得的标准麝香壮骨膏的色谱图；

图15为实施例2测得的15批标准麝香壮骨膏的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统中进行分析导出的截图；

图16为实施例2制定得到的麝香壮骨膏的标准特征图谱。

具体实施方式

以下结合实施例1-4对本发明公开的技术方案作进一步的说明：

实施例1：不同条件下麝香壮骨膏的供试液的hplc测定

1、仪器与药品

仪器：waters高效液相色谱仪，2489检测器。

试药：磷酸(分析纯)；甲醇(色谱级，sigama)；麝香壮骨膏(安科余良卿药业有限公司，批号为20160101)；盐酸苯海拉明对照品(纯度99.9％)，批号为100066-200807。

2、方法与结果

2.1供试液制备

取麝香壮骨膏2片，除去盖衬，剪成小片，置250ml圆底烧瓶中，精密加入甲醇40～60ml，称定重量，回流1小时，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即为供试液，结果表明以回流提取的供试液色谱图较好，如图1所示，故以下2.2均采用回流提取方法制备供试液进行试验。

2.2色谱条件的选择

(1)依据2015年版《中国药典》一部干姜药材项下含测方法色谱条件：采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒径5μm)；以甲醇-乙腈-水(40:5:55)流动相，检测波长为280nm，流速1.0ml/min，柱温30℃。精密吸取供试液10μl，注入液相色谱仪中，测定。在波长为280nm时，色谱峰较少，且分离度不高。如图2所示，说明采用该色谱条件不能很好的反映样品的特征信息。

(2)依据2015年版《中国药典》一部白芷药材项下含测方法色谱条件：采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒径5μm)；以甲醇-水(55：45)为流动相，检测波长为300nm，流速1.0ml/min，柱温30℃。精密吸取供试液10μl，注入液相色谱仪中，测定。在波长为280nm时，色谱峰较少，且分离度不高。如图3所示，说明采用该色谱条件不能很好的反映样品的特征信息。

(3)依据2015年版《中国药典》一部当归药材项下含测方法的色谱条件，采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒径5μm)；以乙腈-0.085％磷酸(17：83)为流动相，检测波长为316nm，流速1.0ml/min，柱温30℃。精密吸取供试液10μl，注入液相色谱仪中，测定。在波长为316nm时，色谱峰较少。如图4所示，说明采用该色谱条件不能很好的反映样品的特征信息。

(4)依据2015年版《中国药典》一部白芷药材项下指纹图谱检测的色谱条件，采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒径5μm)；以甲醇为流动相a，以水为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm，流速1.0ml/min，柱温30℃。精密吸取供试液10μl，注入液相色谱仪中，测定。在波长为254nm时，色谱峰虽然不少多，但分离度很差。如图5所示，说明采用该色谱条件不能很好的反映样品的特征信息。

(5)依据2015年版《中国药典》一部当归药材项下指纹图谱检测的色谱条件，采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒径5μm)；以甲醇为流动相a,以0.4％冰醋酸为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm，流速1.0ml/min，柱温30℃。精密吸取供试液10μl，注入液相色谱仪中，测定。在波长为280nm时，色谱峰虽然不少，但分离度很差。如图6所示，说明采用该色谱条件不能很好的反映样品的特征信息。

(6)依据2015年版《中国药典》一部八角茴香药材项下指纹图谱检测的色谱条件，采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm，粒径5μm)；以甲醇为流动相a,以0.05％磷酸为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm，流速1.0ml/min，柱温30℃。精密吸取供试液10μl，注入液相色谱仪中，测定。在波长为254nm时，色谱峰虽然不少，但分离度很差。如图7所示，说明采用该色谱条件不能很好的反映样品的特征信息。

(7)依据2015年版《中国药典》一部川乌药材项下含测方法的色谱条件，采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒径5μm)；以乙腈-四氢呋喃(25:15)为流动相a,以o.lmol/l醋酸铵溶液(每1000ml加冰醋酸0.5ml)为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；精密吸取供试液10μl，注入液相色谱仪中，测定。检测波长为235nm。在波长为235nm时，色谱峰较少。如图8所示，说明采用该色谱条件不能很好的反映样品的特征信息。

(8)依据2015年版《中国药典》一部草乌药材项下指纹图谱检测的色谱条件，采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒径5μm)；以乙腈-醋酸铵缓冲溶液(2.5‰冰醋酸,用浓氨水调ph10.5左右)(60∶40)为流动相，流速1.0ml/min,检测波长240nm，柱温30℃。精密吸取供试液10μl，注入液相色谱仪中，测定。在波长为240nm时，色谱峰虽然不少，但分离度很差。如图9所示，说明采用该色谱条件不能很好的反映样品的特征信息。

(9)依据2015年版《中国药典》一部关节止痛膏项下盐酸苯海拉明含测方法的色谱条件，采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒径5μm)；以甲醇-1％硫酸铵溶液(47:53)流动相，检测波长为210nm，流速1.0ml/min,，柱温30℃。精密吸取供试液10μl，注入液相色谱仪中，测定。在波长为210nm时，色谱峰较少。如图10所示，说明采用该色谱条件不能很好的反映样品的特征信息。

(10)依据壮骨麝香止痛膏指纹图谱测定方法(申请号为cn101991839a)专利方法，采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒径5μm)；以0.1％-1％三乙胺的水溶液(磷酸调ph2.5-4.5)为流动相a，以乙腈或乙腈和四氢呋喃的混合溶液为流动相b，梯度洗脱；检测波长为200-300nm，流速1.0ml/min，柱温30～50℃。精密吸取供试液10μl，注入液相色谱仪中，测定。在波长为245nm时，色谱峰较少。如图11所示，说明采用该色谱条件不能很好的反映样品的特征信息。

从上述(1)-(10)可以看出，按照以上现有文献的特征图谱或指纹图谱色谱条件方法测定所得的麝香镇痛膏样品的hplc图谱峰较少，不能准确地反映该品种内在质量的特征信息。需要说明的是，图5-9中的峰值数据显示在图中有交叉重叠的问题，导致数据显示不够清楚，但是这些附图主要是说明了采用现有的条件测定得到的图谱存在缺陷，这些图并不对本发明需要保护的技术内容产生影响，故此处不再对附图的具体数据做出说明。

(12)依据本发明公开的色谱条件，采用c18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒径5μm)；以甲醇为流动相a，以0.1％甲酸为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm，流速为1.0ml/min。精密吸取供试液10μl，注入液相色谱仪中，测定，即得。在波长为280nm时，色谱峰的分离度高，且在1小时后色谱峰无明显变化，如图12所示，说明采用该色谱条件能够很好的反映样品的特征信息。

实施例2：麝香壮骨膏的标准特征图谱的构建

1、仪器与药品

仪器：waters高效液相色谱仪，2489检测器。

试药：磷酸(分析纯)；甲醇(色谱级，sigama)；由安徽安科余良卿药业有限公司提供的15批标准麝香壮骨膏，批号分别为20160101、20160501、20160801、20161101、20170101、20170102、20170103、20170301、20170302、20170303、20170304、20170305、20170306、20170401、20170403，上述15批标准麝香壮骨膏依次编号为s1～s15；盐酸苯海拉明对照品(纯度99.9％)，批号为100066-200807。

2、色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径5μm)；以甲醇为流动相a，以0.1％甲酸为流动相b，流动相按体积比为50～80：50～20的a相和b相梯度洗脱，梯度洗脱的时间及流动相比例为：0～50min，a相50％→80％，b相50％→20％；50～60min，a相80％→50％，b相20％→50％，流速0.5ml/min；检测波长280nm；柱温30℃；进样液的进样量为10μl；按照盐酸苯海拉明峰计算，理论塔板数≥10000。

3、标准特征图谱的特征峰的测定

3.1标准特征图谱的构建

(1)标样溶液的制备：取15批上述合格的麝香壮骨膏分别进行回流提取操作，各麝香壮骨膏的回流提取步骤为：取麝香壮骨膏2片，除去盖衬，剪成小片，置250ml圆底烧瓶中，精密加入甲醇40ml，称定重量，回流1小时，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即为标样溶液。

(2)参照物溶液的制备：取盐酸苯海拉明对照品，加甲醇制成每1ml含30μg盐酸苯海拉明的溶液，滤过，取续滤液即为参照物溶液。

(3)高效液相色谱分析：精密吸取参照物溶液和标样溶液各10μl，分别注入液相色谱仪中进行测定，记录60分钟的图谱，即得盐酸苯海拉明对照品的色谱图(见图13)和标准麝香壮骨膏的色谱图(见图14，为批号为20160101的麝香壮骨膏的色谱图)。

(4)标准特征图谱的构建

将检测得到的15批标准麝香壮骨膏的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，相应操作后得到如图15所示的标准麝香壮骨膏的特征图谱，图15中的r号图谱为系统生成的对照图谱，导出即得如图16所示的标准麝香壮骨膏的标准特征图谱。

3.2标准特征图谱中特征峰的确定

经比较15批标准麝香壮骨膏色谱图和盐酸苯海拉明的色谱图，确定麝香壮骨膏的色谱图中有17个特征峰，按出现的时间顺序将这17个特征峰依次编号1～16、s，其中s号色谱峰为盐酸苯海拉明的特征峰，设定s号峰的相对保留时间为1，计算其他16个峰的相对保留时间，结果如表2所示。经计算，1～16号峰的平均相对保留时间分别为：0.10、0.15、0.19、0.21、0.22、0.34、0.36、0.37、0.46、0.57、0.64、0.72、0.76、0.89、0.90、0.92，相对标准差均不超过0.62％。

3.3标准特征图谱的精密度试验

取麝香壮骨膏(批号为20160101)，按照3.1中步骤(1)公开的方法制备成标样溶液，连续进样6次，得到6个色谱图，均出现17个特征峰，设定盐酸苯海拉明的特征峰的相对保留时间为1，计算6个色谱图中其它16个特征峰的相对保留时间。经计算，6个色谱图中16个特征峰的相对保留时间的相对标准偏差rsd≤0.25％。

3.4标准特征图谱的重复性试验

取麝香壮骨膏(批号为20160101)6份，按照3.1中步骤(1)公开的方法分别制备成标样溶液，分别检测得到6个色谱图，均出现17个特征峰，设定盐酸苯海拉明的特征峰的相对保留时间为1，计算6个色谱图中16个特征峰的相对保留时间。经计算，6个色谱图中16个特征峰的相对保留时间的相对标准偏差rsd≤0.12％。

3.5标准特征图谱的稳定性试验

取麝香壮骨膏(批号为20160101)，按照3.1中步骤(1)公开的方法制备成标样溶液，精密吸取6份标样溶液，每份10μl，按上述色谱条件分别在0h、1h、2h、4h、8h和12h进样，检测得到6个色谱图，均出现17个特征峰，设定盐酸苯海拉明的特征峰的相对保留时间为1，计算6个色谱图中16个特征峰的相对保留时间。经计算，6个色谱图中16个特征峰的相对保留时间的相对标准偏差rsd≤0.64％。

以上试验结果表明，采用本发明公开的方法构建得到的麝香壮骨膏的标准特征图谱精密度高，重复性好，结果准确可靠，其能全面的反映麝香壮骨膏的化学信息，进而确保该产品的质量与疗效。

实施例3：麝香壮骨膏的质量检测

1、仪器与试药

仪器：waters高效液相色谱仪，2489检测器。

药品：磷酸(分析纯)；甲醇(色谱级，sigama)；由安徽安科余良卿药业有限公司提供的麝香壮骨膏，批号为20160501；盐酸苯海拉明对照品(纯度99.9％)，批号为100066-200807。

2、色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm,粒径5μm)；以甲醇为流动相a，以0.1％甲酸为流动相b，流动相按体积比为50～80：50～20的a相和b相梯度洗脱，梯度洗脱的时间及流动相比例为：0～50min，a相50％→80％，b相50％→20％；50～60min，a相80％→50％，b相20％→50％，流速1.5ml/min；检测波长280nm；柱温30℃；进样液的进样量为10μl；按照盐酸苯海拉明峰计算，理论塔板数≥10000。

3、特征图谱中的特征峰的测定

(1)待测溶液的制备：取待测麝香壮骨膏2片，除去盖衬，剪成小片，置250ml圆底烧瓶中，精密加入甲醇60ml，称定重量，回流1.5小时，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得待测溶液。

(2)参照物溶液的制备：取盐酸苯海拉明对照品，加甲醇制成每1ml含30μg盐酸苯海拉明的溶液，滤过，取续滤液即为参照物溶液。

(3)高效液相色谱分析：精密吸取参照物溶液和待测溶液各10μl，分别注入液相色谱仪中进行测定，记录60分钟的图谱，即得盐酸苯海拉明对照品的色谱图和待测麝香壮骨膏的色谱图。待测麝香壮骨膏的色谱图中共有17个特征峰，以盐酸苯海拉明的特征峰的相对保留时间为1，其1-16号峰的相对保留时间分别为：0.10、0.15、0.19、0.21、0.22、0.34、0.36、0.37、0.48、0.57、0.64、0.72、0.76、0.89、0.90、0.92。经计算，待测麝香壮骨膏的色谱图中的1-16号峰的相对保留时间与标准特征图谱中相应特征峰的相对保留时间的相对标准偏差在±5％以内，即在规定范围内，说明该麝香壮骨膏(批号为20160501)的质量合格。

实施例4麝香壮骨膏的质量检测

1、仪器与试药

仪器：waters高效液相色谱仪，2489检测器。

药品：磷酸(分析纯)；甲醇(色谱级，sigama)；由安徽安科余良卿药业有限公司提供的麝香壮骨膏，批号分别为20170101；盐酸苯海拉明对照品(纯度99.9％)，批号为100066-200807。

2、色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径5μm)；以甲醇为流动相a，以0.1％甲酸为流动相b，流动相按体积比为50～80：50～20的a相和b相梯度洗脱，梯度洗脱的时间及流动相比例为：0～50min，a相50％→80％，b相50％→20％；50～60min，a相80％→50％，b相20％→50％，流速1.0ml/min；检测波长280nm；柱温30℃；进样液的进样量为10μl；按照盐酸苯海拉明峰计算，理论塔板数≥10000。

3、特征图谱中的特征峰的测定

(1)待测溶液的制备：取待测麝香壮骨膏2片，除去盖衬，剪成小片，置250ml圆底烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，回流1小时，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得待测溶液。

(2)参照物溶液的制备：取盐酸苯海拉明对照品，加甲醇制成每1ml含30μg盐酸苯海拉明的溶液，滤过，取续滤液即为参照物溶液。

(3)高效液相色谱分析：精密吸取参照物溶液和待测溶液各10μl，分别注入液相色谱仪中进行测定，记录60分钟的图谱，即得盐酸苯海拉明对照品的色谱图和待测麝香镇痛膏的色谱图。待测麝香壮骨膏的色谱图中共有17个特征峰，以盐酸苯海拉明的特征峰的相对保留时间为1，其1-16号峰的相对保留时间分别为：0.10、0.15、0.19、0.21、0.22、0.34、0.36、0.37、0.46、0.57、0.64、0.72、0.76、0.89、0.90、0.92。经计算，待测麝香壮骨膏的色谱图中的1-16号峰的相对保留时间与标准特征图谱中相应特征峰的相对保留时间的相对标准偏差在±5％以内，即在规定范围内，说明该麝香壮骨膏(批号为20170101)的质量合格。