一种检测黑猩猩腺病毒adc68的双抗体夹心酶联免疫法，属于免疫分析技术领域。
背景技术：
由于腺病毒具有宿主范围广、高转基因表达能力的特点，目前有高达300种人用治疗或者预防性重组腺病毒药物正用于临床试验，广泛应用的腺病毒载体是人血清型腺病毒adhu2和adhu5型。但由于人群中普遍存在针对常见的人血清型腺病毒的中和抗体，削弱了相应腺病毒载体诱导的免疫反应，阻碍了这些载体在临床上的应用。为避免人群中预存抗体对腺病毒载体疫苗免疫或治疗作用的影响，一批从其他种群来源的型别被越来越多的应用于人类疫苗的研究中，其中就有黑猩猩腺病毒载体adc68。
黑猩猩腺病毒与其他腺病毒一样，都是先在hek293细胞或者per.c6细胞中培养，经过破碎细胞释放病毒和纯化步骤，获得纯化的病毒。本发明采用双抗体elisa法，建立起快速估算黑猩猩腺病毒adc68的方法。该方法有很高的特异性、灵敏度和精密度，与常用的紫外法测病毒颗粒和蚀斑法测病毒滴度相比，其适用性更广，能够测定抗原、滴度、病毒颗粒、蛋白含量等，适合在重组黑猩猩腺病毒纯化工艺过程中的在线检测。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种快速检测黑猩猩腺病毒adc68的elisa方法，用于该型腺病毒培养过程中的在线检测。
本发明以经一定稀释后的纯化重组adc68gfp为标准品，用lorry法测定该纯化重组病毒蛋白浓度，标准品蛋白浓度为38.8ug/ml,残留hek293蛋白含量低于0.3ug/ml其制备方法如下：
（1）将非复制型黑猩猩腺病毒68型病毒以moi1~10的比例，接种静置培养的hek293单层细胞，待细胞完全病变后，收获病变的细胞。冻融三次后，剧烈震荡裂解细胞释放病毒；
（2）再经过两次不连续氯化铯密度梯度超速离心获得纯化病毒，纯化病毒再通过脱盐柱处理后，用含10%甘油的pbs保存于-70℃超低温冰箱中备用。
本发明以纯化过的兔抗adc68抗体为包被抗体，其制备方法如下：以纯化重组adc68gfp病毒接种家兔，采集免疫家兔血清，测定中和滴度，取不低于中和滴度/1280的抗血清经硫酸铵沉淀粗纯，再经proteing粗纯，获得纯化抗体。
本发明中酶标抗体为hrp酶标记的山羊抗腺病毒hexon抗体（购自invitrogen），含2%羊血清的pbst为样品稀释液，通过双抗体夹心酶联免疫法测定腺病毒。具体实验步骤为：
（1）包被抗体：纯化抗体用包被缓冲液（碳酸钠溶液）稀释，最佳包被浓度为1：50，每孔100ul，4℃过夜；
（2）封闭：洗涤后，用pbst（含0.1%吐温20的pbs）配制2%bsa，每孔200ul，37℃封闭2h；
（3）捕获抗原：标准参考品和待测定样品用含2%羊血清pbst稀释，加样量为100ul，37℃孵育1hr；
（4）加入酶标抗体：洗涤后，加hrp标记的羊抗腺病毒hexon（购自invitrogen），使用浓度为1：500，每孔100ul，37℃孵育1hr；
（5）显色：洗涤后，用含0.01%tmb的显色液100ul，室温避光显色30min。
（6）读数:加每孔50ul2mh2so4溶液终止，od450/630nm波长测定吸收值。
本发明筛选并优化了包被抗体的浓度，通过实验确定了参考品的最佳线性范围为1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320、1/640，对应浓度为7.76ug/ml、3.88ug/ml、1.94ug/ml、0.97ug/ml、0.48ug/ml、0.24ug/ml、0.12ug/ml、0.06ug/ml。用该方法能够测量黑猩猩腺病毒adc68抗原、滴度、病毒颗粒、蛋白含量等。
图1是实施例1中标准蛋白浓度对吸光值的标准曲线图。
具体实施例
实施例1绘制标准曲线
1）操作
纯化抗体用包被缓冲液稀释，最佳包被浓度为1：50，每孔100ul，4℃过夜；洗涤后，用pbst（含0.1%吐温20的pbs）配制2%bsa，每孔200ul，37℃封闭2hr；标准参考品和待测定样品用含2%羊血清pbst稀释，加样量为100ul，37℃孵育1hr；洗涤后，加hrp标记的羊抗腺病毒hexon，使用浓度为1：500，每孔100ul，37℃孵育1hr；洗涤后，用含0.01%tmb的显色液100ul，室温避光显色30min。
2）作图
将纯化病毒标准品做1/5、1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320、1/640系列稀释，各稀释参考品浓度为7.76ug/ml、3.88ug/ml、1.94ug/ml、0.97ug/ml、0.48ug/ml、0.24ug/ml、0.12ug/ml、0.06ug/ml。按照确定的双抗体elisa方法，测定标准品。根据各标准品对应的od450/630值做散点图并直线回归，如图1所示。在3.88ug/ml~0.06ug/ml的范围内，线性相关性最佳，相关系数r=0.9996。
附图说明：横坐标为标准品蛋白浓度，单位ug/ml；纵坐标为od450/630吸光值。公式为回归方程，r为相关系数。
图1标准曲线
实施例2准确度、精密度验证
按照本发明方法操作，将adc68标准品稀释，配制高低两个浓度的样品，含蛋白分别为0.776ug/ml、0.388ug/ml，用建立的elisa法重复测定9次，计算样品回收率、变异系数等（见表），结果显示，测定的回收率在84.38%至102.6%之间，变异系数分别为3.44%、6.72%，说明方法有很好的准确度和精密度，能够准确测定病毒蛋白含量。
表1
实施例3
按照本发明进行实验操作，选取腺病毒adc68纯化工艺研究过程中不同的样品，测定抗原病毒蛋白含量。同时测定滴度、病毒颗粒。验证建立的双抗体elisa方法的适用性。表2中病毒蛋白为本发明方法测得数据。从对病毒纯化过程中的样品检测来看，建立的elisa方法能很好的检测出重组病毒蛋白的含量，与测得病毒滴度和病毒颗粒数有很好的相关性。并且，通过与样品病毒滴度的对比，计算比活，能大致推算出不同纯化步骤对adc68病毒纯度的影响，纯化方法1明显优于2、3。
表2不同纯化方法比较