用于尺寸排阻色谱分离的保护柱构造的制作方法

用于尺寸排阻色谱分离的保护柱构造
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年4月15日提交的并且名称为“用于mab片段的sec分离的保护柱(guard column for sec separation of mab fragments)”的美国临时申请号63/010,493的权益，该临时申请的全部公开内容据此以引用方式并入。
技术领域
3.本公开涉及与尺寸排阻色谱分析柱一起使用的保护柱，特别是用于基于尺寸分离蛋白质和蛋白质片段的那些保护柱。


背景技术：

4.尺寸排阻色谱法(sec)是其中按分子的尺寸来分离溶液中的分子的一种色谱方法。sec色谱法的主要应用是蛋白质和其他水溶性聚合物的分级分离。各种sec柱可从沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德)(waters corporation(milford ma,usa))和其他供应商处商购获得。
5.sec柱的过早失效通常可归因于分析柱头部的样品或流动相来源的微粒(例如蛋白质聚集体、微生物等)或样品赋形剂(例如，表面活性剂等)的积聚。保护柱的使用是保护分析柱免于这类失效的有效方法，但通常以分离性能为代价。这种性能由于添加保护柱可引起的柱外分散(频带散布)增加而受到损害。因为它们缺乏特定的柱上保留机制(例如，离子、疏水性、化学等)，所以基于尺寸的分离技术特别易受样品分散的柱外来源影响。一些sec使用者通过采用具有相对高体积的填充床的保护柱来减轻这些增添的分散效果。进行要求更高的分离的其他使用者不愿意损害性能，因此完全避免使用保护柱，选择更短的分析柱寿命。这些方法中的任一种方法都具有大幅增加的财务成本。
6.本公开中概述的方法通过基本上保持最佳分离性能并且通过提供降低成本的解决方案来解决这些问题。这些方法通过提供对微粒和/或化学污染的防护来延长分析柱的寿命，而不会显著损害分析柱进行关键分离(诸如mab单体-夹片分离)的能力，其中物质之间的分子量差异较小。


技术实现要素：

7.在各种实施方案中，提供了一种用于尺寸排阻色谱法(sec)的色谱系统，该色谱系统包括入口、出口、分析柱和保护柱，该分析柱具有第一内部体积，该第一内部体积具有第一长度和垂直于该第一长度的第一横截面积，该第一内部体积容纳第一固定相，该保护柱具有第二内部体积，该第二内部体积具有第二长度和垂直于该第二长度的第二横截面积，该第二内部体积容纳第二固定相。该入口与该保护柱流体连通，该保护柱与该分析柱流体连通，并且该分析柱与该出口流体连通。此外，该第二长度小于该第一长度，并且该第二横截面积小于该第一横截面积。
8.在这些实施方案中的一些实施方案中，该第一内部体积呈第一圆柱体的形式，其
中该第一长度对应于该第一圆柱体的长度并且该第一横截面积对应于该第一圆柱体的圆形横截面和/或该第二内部体积呈第二圆柱体的形式，其中该第二长度对应于该第二圆柱体的长度并且该第二横截面积对应于该第二圆柱体的圆形横截面。
9.在可以与上述实施方案一起使用的一些实施方案中，第二横截面积小于第一横截面积的50％。
10.在可以与上述实施方案一起使用的一些实施方案中，第一横截面积范围为10mm2或更小至120mm2或更大，例如范围为10mm2至20mm2至30mm2至40mm2至50mm2至60mm2至80mm2至100mm2至120mm2(换句话说，介于前述值中的任两个值之间的范围)。
11.在可以与上述实施方案一起使用的一些实施方案中，第二长度小于第一长度的20％。
12.在可以与上述实施方案一起使用的一些实施方案中，第一长度范围为50mm或更小至500mm或更大。
13.在可以与上述实施方案一起使用的一些实施方案中，保护柱集成到分析柱的入口端。
14.在可以与上述实施方案一起使用的一些实施方案中，第一固定相和第二固定相包含第一固定相颗粒和第二固定相颗粒。
15.在可以与上述实施方案一起使用的一些实施方案中，第一固定相颗粒的直径范围为1μm至10μm。
16.在可以与上述实施方案一起使用的一些实施方案中，第一固定相颗粒的平均孔径范围为50埃至1000埃。
17.在可以与上述实施方案一起使用的一些实施方案中，第一固定相颗粒包含包含共价附接的亲水性表面部分的散装材料。
18.在可以与上述实施方案一起使用的一些实施方案中，散装材料是硅基无机-有机杂化材料。
19.在可以与上述实施方案一起使用的一些实施方案中，共价附接的亲水性表面部分包含二羟化脂族基团。
20.在可以与上述实施方案一起使用的一些实施方案中，共价附接的亲水性表面部分包含羟基封端的聚(烯化氧)基团。
21.在可以与上述实施方案一起使用的一些实施方案中，第一固定相颗粒和第二颗粒相同或不同。
22.在可以与上述实施方案一起使用的一些实施方案中，第二颗粒是无孔颗粒。
23.在可以与上述实施方案一起使用的一些实施方案中，第二颗粒是多孔颗粒。
24.在可以与上述实施方案一起使用的一些实施方案中，第二颗粒的直径范围为1μm至10μm。
25.在可以与上述实施方案一起使用的一些实施方案中，第二颗粒包含选自无机材料、有机材料和无机-有机杂化材料的散装材料。
26.在可以与上述实施方案一起使用的一些实施方案中，散装材料包含附接的亲水性表面部分。
27.在一些实施方案中，本公开提供了尺寸排阻色谱的方法，该方法包括：(a)将包含
蛋白质的溶液上样到上述实施方案中的任何实施方案的该系统的该入口中，以及(b)以足以洗脱通过该系统的该蛋白质的至少一部分并且在该系统的该出口处形成洗脱液料流的体积将流动相引入该系统的该入口中。
附图说明
28.图1是根据本公开的实施方案的用于尺寸排阻色谱法的色谱系统的示意图。
29.图2示出了单克隆抗体(mab)的尺寸变体分离的典型sec色谱图。
30.图2a说明了用于计算两个良好分辨的相邻峰之间的半高分辨率的方法。
31.图2b说明了用于计算峰高与谷高比率(p/v)的方法，该方法用于描述更难以分辨的峰的分辨率的质量。
32.图3b至图3e含有在4.6mm
×
150mm分析柱上游使用3.9mm
×
5mm保护柱生成的色谱图，其中保护柱含有四种不同颗粒类型：1.7μm beh200颗粒(图3b)、2.5μm beh200颗粒(图3c)、3.5μm beh200颗粒(图3d)、3μm无孔聚(苯乙烯二乙烯基苯)颗粒(图3e)。图3a是使用保护柱被绕过的4.6mm
×
150mm分析柱生成的色谱图。
33.图4b至图4e含有在4.6mm
×
150mm分析柱上游使用2.1mm
×
5mm保护柱生成的色谱图，其中保护柱含有四种不同颗粒类型：1.7μm beh200颗粒(图4b)、2.5μm beh200颗粒(图4c)、3.5μm beh200颗粒(图4d)、3μm无孔聚(苯乙烯二乙烯基苯)颗粒(图4e)。图4a是使用保护柱被绕过的4.6mm
×
150mm分析柱生成的色谱图。
34.图5b至图5e含有在4.6mm
×
150mm分析柱上游使用保护件生成的色谱图，如下：waters acquity
tm
串联过滤器(图5b)、含有1.7μmbeh200颗粒的2.1mm
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5mm保护柱(图5c)、含有2.5μm beh200颗粒的2.1mm
×
5mm保护柱(图5d)和含有2.5μm beh200颗粒的2.1mm
×
30mm保护柱(图5e)。图5a是使用保护柱被绕过的4.6mm
×
150mm分析柱生成的色谱图。
35.图6a是在7.8mm
×
300mm分析柱上游使用4.6mm
×
30mm保护柱生成的色谱图。图6b是使用7.8mm
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300mm分析柱而没有4.6mm
×
30mm保护柱生成的色谱图。
36.图7b至图7e含有在7.8mm
×
300mm分析柱上游使用4.6mm
×
30mm保护柱生成的色谱图。填充到4.6mm
×
30mm保护柱中的颗粒和流动条件如下：3738psi的2.5μm beh200颗粒(图7b)、4326psi的1.7μm beh200颗粒(图7c)、3885psi的2.5μm beh450颗粒(图7d)和3955psi的2.5μm beh125颗粒(图7e)。图7a是在3380psi下使用7.8mm
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300mm分析柱而没有4.6mm
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30mm保护柱生成的色谱图。
37.图8b至图8e含有在7.8mm
×
300mm分析柱上游使用填充有2.5μmbeh200颗粒的7.8mm
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30mm保护柱生成的色谱图。流动条件如下：3618psi的2.5μm beh200颗粒(图8b)、3716psi的2.5μm beh200颗粒(图8c)、3594psi的2.5μm beh200颗粒(图8d)和3486psi的2.5μmbeh200颗粒(图8e)。图8a是在4004psi下使用7.8mm
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300mm分析柱而没有7.8mm
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30mm保护柱生成的色谱图。
具体实施方式
38.转到图1，示出了用于尺寸排阻色谱法的色谱系统10，该色谱系统包括入口10i、出口10o、分析柱20和保护柱30，该分析柱具有限定容纳第一固定相的第一内部体积22的至少一个第一壳体24，该保护柱具有限定容纳第二固定相的第二内部体积32的至少一个第二壳
体34。入口10i与保护柱30流体连通，保护柱30与分析柱20流体连通，并且分析柱20与出口10o流体连通。通过系统的流量处于箭头所示的方向。第一内部体积22具有第一长度22l和垂直于第一长度22l的第一横截面积22a。示出了第一横截面积22a的一维(即，第一横截面积22a的高度)。第二内部体积32具有第二长度32l和垂直于第二长度32l的第二横截面积32a。示出了第二横截面积32a的一维(即，第二横截面积32a的高度)。分析柱的第一固定相和保护柱的第二固定相可以相同或不同。在一些实施方案中，第二长度32l小于第一长度22l，和/或第二横截面积32a小于第一横截面积32a。在一些实施方案中，第一壳体24和第二壳体34中的每一者均呈金属管的形式。
39.应当注意，虽然图1中说明了具有填充的固定相的保护柱30，但是也可以采用诸如膜或玻璃料过滤器装置等其他保护件代替保护柱30。
40.在一些实施方案中，固定相材料(用于分析柱、保护柱或两者)是多孔固定相材料。在这些实施方案中的一些实施方案中，多孔固定相材料的平均孔径范围为50埃或更小到3000埃或更大。例如，平均孔径可以在50埃至100埃至250埃至500埃至1000埃至3000埃的范围内(即，平均孔径可以在前述值中的任何两个值之间的范围)。平均孔径(apd)通过常规的孔隙度测定方法测量。对于亚-500埃孔隙，可以使用多点n2吸附法测量平均孔径(apd)(micromeritics asap 2400；佐治亚州克罗斯的克默瑞提克公司(micromeritics instruments inc.,norcross,ga))，使用如本领域已知的bjh方法从等温线的解吸附腿计算apd。如在本领域中已知的，hg孔隙度测定法可以用于400埃或更大的孔隙。
41.在一些实施方案中，固定相材料(用于分析柱、保护柱或两者)呈颗粒的形式。在这些实施方案中的一些实施方案中，固定相呈球形颗粒的形式。这类颗粒的直径范围可以为0.25μm或更小至100μm或更大，例如范围为0.25μm至0.5μm至1μm至2.5μm至5μm至10μm至25μm至50μm至100μm。
42.在这些实施方案中的一些实施方案中，分析柱和保护柱可以设置有一种或多种玻璃料(例如，在柱的每个末端具有至少一种玻璃料)以将微粒状固定相材料保持在柱的内部体积内。
43.用于分析柱、保护柱或两者的固定相材料包括：包含具有共价附接的亲水性表面部分的散装材料(例如，微粒散装材料)的那些固定相材料。
44.散装材料可以选自无机散装材料(例如，二氧化硅、氧化铝、钛、铈或锆或其氧化物，或陶瓷材料)、有机散装材料(例如，有机聚合物)和无机-有机杂化材料。“有机-无机杂化材料”包括基于无机物的结构，其中有机官能团与内部或“骨架”无机结构以及杂化材料表面均成一体。杂化材料的无机部分可以是例如二氧化硅、氧化铝、钛、铈或锆或其氧化物，或陶瓷材料。示例性杂化材料示于美国专利第4,017,528号、第6,528,167号、第6,686,035号、第7,175,913号和第7,919,177号中，这些专利的公开内容特此整体并入。
45.在一些实施方案中，散装材料可以包括硅基无机-有机杂化材料，该硅基无机-有机杂化材料包括：其中该材料包含具有四个硅-氧键的硅原子的无机区域和其中该材料包含具有一个或多个硅-氧键和一个或多个硅-碳键的硅原子的杂化区域。在一些情况下，杂化区域可以包含桥接两个或更多个硅原子的经取代或未取代的亚烷基、亚烯基、亚炔基或亚芳基部分。例如杂化区域可以包含桥接两个或更多个硅原子的经取代或未取代的c
1-c
18
亚烷基、c
2-c
18
亚烯基、c
2-c
18
亚炔基或c
6-c
18
亚芳基部分。在特定实施方案中，杂化区域可以
包含桥接两个或更多个硅原子的经取代或未取代的c
1-c6亚烷基部分，包括桥接两个硅原子的亚甲基、二亚甲基或三亚甲基部分。在特定实施方案中，杂化区域可以包含≡si-(ch2)
n-si≡部分，其中n是整数并且可以等于1、2、3、4、5、6或更大。
46.在一些实施方案中，硅基无机-有机杂化材料可以通过水解缩合一种或多种烷氧基硅烷化合物来形成。烷氧基硅烷化合物的示例包括例如四烷氧基硅烷(例如，四甲氧基硅烷(tmos)、四乙氧基硅烷(teos)等)、烷基烷氧基硅烷诸如烷基三烷氧基硅烷(例如，甲基三甲氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷(mtos)、乙基三乙氧基硅烷等)和双(三烷氧基甲硅烷基)烷烃(例如，双(三甲氧基甲硅烷基)甲烷、双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷、双(三乙氧基甲硅烷基)甲烷、双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷(bte)等)，以及前述的组合。在这些实施方案中的某些实施方案中，硅基无机-有机杂化材料可由两种烷氧基硅烷化合物制备，例如：四烷氧基硅烷，诸如tmos或teos，和烷基烷氧基硅烷诸如mtos，或双(三烷氧基甲硅烷基)烷烃诸如btee。当采用btee时，所得材料是有机-无机杂化材料，其有时被称为乙烯桥接杂化(beh)材料，并且可提供优于常规二氧化硅的各种优点，包括化学稳定性和机械稳定性。一种特定的beh材料可以由teos和btee的水解缩合形成。
47.如先前所示，用于分析柱、保护柱或两者的固定相材料包括：包含具有共价附接的亲水性表面部分的散装材料的那些固定相材料以及在一些实施方案中，包含具有共价附接的亲水性表面部分的微粒散装材料的颗粒。以上描述了各种散装材料。
48.在一些实施方案中，共价附接的亲水性表面部分可以包含多羟基化脂族基团，例如，其中两个羟基位于脂肪链中的相邻碳原子上的二羟化脂族基团(例如，二羟基丙基)，也称为二醇基团。在散装材料的表面包含硅烷醇基团的特定实施方案中(例如二氧化硅和硅基无机-有机杂化散装材料)，共价附接的亲水性表面部分可以包含(二羟基烷氧基)烷基硅烷基团，例如(二羟基-c1c
4-烷氧基)c1c
4-烷基硅烷基团，诸如[3-(2,3-二羟基丙氧基)丙基]-硅烷基团。
[0049]
用于基于蛋白质的sec的各种柱可从沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德)(waters corporation(milford ma,usa))获得，这些柱含有经共价附接的二醇基团修饰的多孔硅基无机-有机杂化材料(桥接乙烯杂化(beh)颗粒)。与硅基二醇涂覆颗粒相比，用表面改性的二醇基团修饰的beh颗粒提供硅烷醇活性的显著降低，从而减少sec颗粒与蛋白质之间不期望的离子相互作用。另外，beh颗粒的高机械强度使得粒度能够减小到1.7μm或更小，从而提供色谱效率的增益和有效减少sec分析时间的能力。除1.7μm尺寸外，基于beh的sec颗粒还可以2.5μm和3.5μm的尺寸获得。基于beh的sec颗粒可以(beh125)、(beh200)和(beh450)的孔径获得。
[0050]
在其他实施方案中，共价附接的亲水性表面部分可以包括基于peg的表面部分。在一些实施方案中，诸如以上所描述的那些的散装材料包含共价附接的亲水性表面部分，该亲水性表面部分包含羟基封端的聚(烯化氧)基团，特别是羟基封端的聚乙二醇(peg)基团。在散装材料的表面包含硅烷醇基团的特定实施方案中(例如二氧化硅和硅基无机-有机杂化散装材料，诸如beh颗粒)，共价附接的亲水性表面部分可以包含式
其中m是约1至约10的整数，n是约2至约50的整数，并且波浪线指示与散装材料的表面的附接点。这些和其他材料在标题为“经由减少二次相互作用用于改善尺寸排除色谱法中的色谱分离的吸附剂(a sorbent used to improve chromatographic separations in size exclusion chromatography via reduced secondary interactions)”的共同待决的美国专利申请第63/079,301号中有描述，其公开内容特此通过引用并入。
[0051]
图2中示出了单克隆抗体(mab)的尺寸变体分离的典型sec色谱图以及相关命名法。所关注的一种色谱参数是主要单体峰与其最近洗脱尺寸变体(～100kda)之间的分辨率，该变体称为其夹片、fab/c或lmw1。对于合理分辨的峰，使用半高usp分辨率(r(usp,hh))来描述分辨率的质量(参见图2a)。另一方面，对于更难以分辨的峰，使用峰高与谷高比率(p/v)来描述分辨率的质量(参见图2b)。在这项计算中，峰高是指2个不良分辨峰中的最小者，并且谷高是介于2个不良分辨峰之间的。
[0052]
本文描述了用于sec色谱柱的保护柱的各种新方法，尤其包括如图1所示的色谱系统，这些新方法可以连同用于尺寸排阻色谱法(sec)的色谱系统一起采用。如先前所述，基于尺寸的分离技术对样品分散的柱外来源高度敏感。这类分散可以由各种因素引起，包括增添的死体积和/或质量差的配件以及整个hplc系统中位于进样器与系统检测器之间的管材连接。紧邻分析柱上游放置保护柱不可避免地增添了死体积和连接。然而，通过减少与sec保护柱相关的柱外分散来源，可以维持基于临界尺寸的分离(诸如mab单体-夹片分离)的足够分辨率，其中物质之间的分子量差异较小，同时提供了分析柱对微粒和化学污染的防护。
[0053]
根据本公开，从保护柱减少柱外分散贡献可以通过包括但不限于以下中的一种或多种的方法来实现：减小保护柱内部体积直径(并且因此减小保护柱内部体积横截面积)，减小保护柱内部体积长度，减小所需的连接数量，修改连接类型，修改保护柱的内部体积几何形状(包括圆锥形、锥形或其他非圆柱体几何形状)，对于保护柱利用替代固定相诸如无孔颗粒，利用具有单分散粒度的固定相，利用具有不同粒度的固定相(例如，使用直径比分析柱颗粒的直径大至少25％或小至少25％的保护柱)，利用具有不同粒度分布的固定相，利用具有不同孔径的固定相(例如，使用平均孔径比分析柱颗粒的平均孔径大至少25％或小至少25％的保护柱颗粒)，利用具有不同孔径分布的固定相，利用膜作为保护件代替填充床保护柱，和/或利用玻璃料过滤器装置作为保护件代替填充床保护柱，以及其他方法。
[0054]
本公开的填充床保护柱中使用的颗粒可以与联接的分析柱中使用的颗粒相同或不同。因此，保护柱颗粒可以包括上述颗粒中的任何颗粒。
[0055]
在一些实施方案中，可以提供保护柱，其中保护柱的内部体积的横截面积小于所采用的分析柱的内部体积的横截面积的50％。例如，保护柱的内部体积的横截面积可以在分析柱的内部体积的横截面积的10％至20％至30％至40％至50％的范围内。在一些实施方
案中，分析柱的内部体积的宽度范围为4mm至10mm，其中通常在本领域中发现4.6mm和7.8mm的宽度。
[0056]
在一些实施方案中，可以提供保护柱，其中保护柱的内部体积的长度小于所采用的分析柱的内部体积的长度的20％。例如，保护柱的内部体积的长度可以在分析柱的内部体积的长度的1％至2％至3％至5％至10％至20％的范围内。在一些实施方案中，分析柱的内部体积的长度可以为50mm或更小至500mm或更大，例如，在50mm至100mm至150mm至200mm至300mm至400mm至500mm的范围内。
[0057]
根据本公开的色谱系统还可以采用一体式保护柱，其中不需要套圈连接并且保护柱集成到分析柱入口端螺母中(诸如在来自沃特世公司(waters corporation)的vanguard
tm
fit中发现的，其中去除了保护柱与分析柱之间的外部管材和套圈连接，从而允许容易且可重复地进行连接，并且允许减小柱外体积)。还可以采用直接连接式保护件(诸如在vanguard
tm
前置柱中发现的)，这些保护件具有提供更高效率、更高分辨率和增加的分离通量的一件式设计。在一些实施方案中，可以使用来自沃特世公司(waters corporation)的串联过滤器(仅玻璃料)试剂盒。
[0058]
本公开另外的方面涉及的方法包括：(a)将包含蛋白质的溶液上样到具有上述保护柱和分析柱构造中的任一者的系统的入口中，并且(b)以足以洗脱通过该系统的该蛋白质的至少一部分并且在该系统的出口处形成洗脱液料流的体积将流动相引入该系统的该入口中。在一些实施方案中，蛋白质是单克隆抗体。在一些实施方案中，流动相是水性流动相，例如，缓冲水性流动相，诸如以下实施例中使用的磷酸钠/kcl缓冲溶液。
[0059]
实施例
[0060]
在以下实施例中，在以下实验条件下(或在类似的实验条件下)进行mab尺寸变体测试：
[0061]
系统h级-10(h-class bio)
[0062]
带ftn样品管理器的waters acquity uplc h级系统，1mm针头从底部放置；带钛流动池的tuv；qsm；和30cm ch-a柱加热器(有源)
[0063]
mab尺寸变体测试等度条件
[0064]
流动相a：50mm磷酸钠缓冲液+200mm kcl
[0065]
柱温：35℃
[0066]
uv波长：280nm
[0067]
进样体积：10μl
[0068]
流速：575μl/分钟
[0069]
针头洗涤：milli-q水
[0070]
吹扫：milli-q水
[0071]
密封件洗涤：10％甲醇/90％ milli-q水
[0072]
样品(浓度)
[0073]
1.waters mab尺寸变体标准(sku：186009429)(2.28mg/ml)
[0074]
2.在流动相a中的尿嘧啶(0.1mg/ml)
[0075]
报告的每张色谱图的测试序列
[0076]
1.流动相a测试流速平衡在1.15ml/分钟(60分钟)(35℃)
[0077]
2.流动相a测试流速平衡在0.575ml/分钟(10分钟)(35℃)
[0078]
3.以0.575ml/分钟(22.8μg载量)在流动相a中1次进样10μlmab尺寸变体(23分钟)(35℃)
[0079]
4.tg调节(4次进样)(180μg载量)
[0080]
5.以0.575ml/分钟(45.6μg载量)在流动相a中2次进样10μlmab尺寸变体(23分钟)(35℃)
[0081]
6.以1.0ml/分钟在缓冲液中3次进样尿嘧啶效率测试物(30℃)
[0082]
*报告了第2次进样结果。
[0083]
实施例1
[0084]
在该实施例中，研究了保护柱直径及颗粒类型和直径对夹片分辨率的影响。所有情况下的分析sec柱都是4.6mm
×
150mm vanguard
tm
fit分析柱。测试两个保护柱尺寸：3.9mm
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5mm vanguard
tm
盒式柱和2.1mm
×
5mm vanguard
tm
盒式柱。测试四种颗粒类型：1.7μm beh200颗粒、2.5μmbeh200颗粒、3.5μm beh200颗粒和3μm无孔聚(苯乙烯-二乙烯基苯)涂覆颗粒。
[0085]
图3b至图3e含有在4.6mm
×
150mm分析柱上游使用3.9mm
×
5mm保护柱生成的色谱图，其中保护柱含有四种不同颗粒类型：1.7μm beh200颗粒(图3b)、2.5μm beh200颗粒(图3c)、3.5μm beh200颗粒(图3d)、3μm无孔聚(苯乙烯二乙烯基苯)颗粒(图3e)。图3a是使用保护柱被绕过的4.6mm
×
150mm分析柱生成的色谱图。
[0086]
图4b至图4e含有在4.6mm
×
150mm分析柱上游使用2.1mm
×
5mm保护柱生成的色谱图，其中保护柱含有四种不同颗粒类型：1.7μm beh200颗粒(图4b)、2.5μm beh200颗粒(图4c)、3.5μm beh200颗粒(图4d)、3μm无孔聚(苯乙烯二乙烯基苯)颗粒(图4e)。图4a是使用保护柱被绕过的4.6mm
×
150mm分析柱生成的色谱图。
[0087]
正如通过比较图3a至图3e与图4a至图4e可见，直径2.1mm的保护柱具有比直径3.9mm的保护柱更接近旁路版本的分辨率性能。另一方面，结果相对独立于颗粒尺寸和类型，其中无孔惰性ps-dvb颗粒似乎表现得和beh颗粒一样好。
[0088]
实施例2
[0089]
在该实施例中，研究了各种保护件对夹片分辨率的影响。所有情况下的分析sec柱都是4.6mm
×
150mm分析柱(标准版本)。采用四种保护件：含有0.2μm不锈钢过滤器的waters acquity
tm
串联过滤器、含有1.7μm beh200颗粒的2.1mm
×
5mm vanguard
tm
前置柱(直接连接型)、含有2.5μm beh200颗粒的2.1mm
×
5mm vanguard
tm
前置柱(直接连接型)和含有2.5μm beh200颗粒的waters直接连接hp 2.1mm
×
30mm前置柱。
[0090]
图5b至图5e含有在4.6mm
×
150mm分析柱上游使用这些保护件生成的色谱图，如下：waters acquity
tm
串联过滤器(图5b)、含有1.7μmbeh200颗粒的2.1
×
5mm保护柱(图5c)、含有2.5μm beh200颗粒的2.1mm
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5mm保护柱(图5d)和含有2.5μm beh200颗粒的2.1mm
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30mm保护柱(图5e)。图5a是使用保护柱被绕过的4.6mm
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150mm分析柱生成的色谱图。
[0091]
与实施例1的vanguard
tm
fit分析柱完全不同，在所有情况下，使用4.6mm
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150mm柱的标准版本，夹片相对分辨良好。当与waters acquity
tm
串联过滤器(仅含玻璃料)配对时，存在一定夹片分辨率损失。当与填充床(直接连接)前置柱联接时，夹片分辨率通常得以保持。粒度不显著影响性能，也不保护柱长。
[0092]
实施例3
[0093]
在该实施例中，研究了含有1.7μm beh200颗粒的4.6mm
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30mm waters保护柱对夹片分辨率的影响。每种情况下的分析sec柱都是含有2.5μm beh200颗粒的waters 7.8mm
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300mm分析柱。
[0094]
图6a是在7.8mm
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300mm分析柱上游使用4.6mm
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30mm保护柱生成的色谱图。图6b是使用7.8mm
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300mm分析柱而没有4.6mm
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30mm保护柱生成的色谱图。
[0095]
正如从这些色谱图中看到的，当使用4.6mm
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30mm保护柱时，夹片分辨率只有轻微损失。
[0096]
实施例4
[0097]
在该实施例中，研究了保护柱直径及颗粒类型和直径对夹片分辨率的影响。每种情况下的分析sec柱都是含有2.5μm beh200颗粒的waters xbridge 7.8mm
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300mm分析柱。测试两种保护柱：4.6mm
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30mm waters保护柱和7.8mm
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30mm waters保护柱。测试四种颗粒类型：1.7μmbeh200颗粒、2.5μm beh125颗粒、2.5μm beh200颗粒和2.5μm beh450颗粒。
[0098]
图7b至图7e含有在7.8mm
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300mm分析柱上游使用4.6mm
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30mm保护柱生成的色谱图。填充到4.6mm
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30mm保护柱中的颗粒和流动条件如下：3738psi的2.5μm beh200颗粒(图7b)、4326psi的1.7μm beh200颗粒(图7c)、3885psi的2.5μm beh450颗粒(图7d)和3955psi的2.5μm beh125颗粒(图7e)。图7a是在3380psi下使用7.8mm
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300mm分析柱而没有4.6mm
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30mm保护柱生成的色谱图。
[0099]
图8b至图8e含有在7.8mm
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300mm分析柱上游使用填充有2.5μmbeh200颗粒的7.8mm
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30mm保护柱生成的色谱图。流动条件如下：3618psi的2.5μm beh200颗粒(图8b)、3716psi的2.5μm beh200颗粒(图8c)、3594psi的2.5μm beh200颗粒(图8d)和3486psi的2.5μmbeh200颗粒(图8e)。图8a是在4004psi下使用7.8mm
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300mm分析柱而没有7.8mm
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30mm保护柱生成的色谱图。