方法、阵列和其用途与流程

1.本发明提供了用于确定胰腺癌相关疾病状态(如胰腺癌存在或胰腺癌的风险)的体外方法，以及用于这些方法的阵列和试剂盒。


背景技术：

2.胰腺癌是一种相对罕见但致死率很高的癌症，其中5年存活率小于10％(ilic和ilic,2016)。胰腺癌的高死亡率使其成为美国癌症相关死亡的第三大原因(rawla等人,2019)。这一令人沮丧的记录背后的一个因素是缺乏早期和疾病特异性临床症状。在诊断时，患者通常已经发展为晚期疾病，并且仅大约15-20％的患者具有可切除肿瘤(conlon等人,1996；sohn等人,2000)。对于在早期检测到的较小肿瘤，已经报道了显著更好的结果。已经报道了大小小于20mm的肿瘤的5年存活率为30％至60％，并且大小小于10mm的肿瘤的5年存活率甚至超过75％(shimizu等人,2005；kenner等人,2016)。
3.胰腺导管腺癌(pdac)是最常见的胰腺癌类型，其占所有胰腺恶性肿瘤的90％以上(mcguigan等人,2018)。快速肿瘤进展、早期转移和对常规化学疗法的抗性是pdac的标志(orth等人,2019)。由于完全手术去除是针对pdac的唯一潜在治愈性治疗，因此迫切需要用于早期检测的生物标志物。pdac的最常评估的生物标志物ca19-9在若干种良性疾病(例如，慢性胰腺炎和梗阻性黄疸)中在水平升高的情况下特异性和灵敏度不足，并且在对路易斯血型(lewis blood type)呈阴性的患者(占人口的约5-10％)中完全不存在。因此，不推荐使用血清ca19-9本身进行筛查，但可以提供关于预后、对化学疗法的应答的重要信息以及预测术后复发(ballehaninna和chamberlain,2011)。
4.总之，仍然需要诊断如pdac等胰腺癌的改进方法，具体地在疾病的早期，并且已经假定早期诊断将会引起患有pdac的患者的存活率增加并且所选择的高风险人群可以从用于检测癌症发展的非侵入性测试中极大地受益。


技术实现要素：

5.因此，本发明的第一方面提供了一种用于诊断或确定胰腺癌相关疾病状态的方法，所述方法包括以下步骤或由其组成：
6.(a)提供来自待测试的个体的样品；以及
7.(b)通过测量选自在表a中定义的组的一种或多种生物标志物在测试样品中的存在和/或量来确定所述测试样品的生物标志物特征；
8.其中选自在表a中定义的所述组的所述一种或多种生物标志物在所述测试样品中的存在和/或量指示所述个体的所述胰腺癌相关疾病状态。
9.在优选的实施例中，步骤(b)包括通过测量选自在表a中定义的组的两种或更多种生物标志物在测试样品中的存在和/或量来确定所述测试样品的生物标志物特征，其中选自在表a中定义的所述组的所述两种或更多种生物标志物在所述测试样品中的存在和/或量指示所述个体的所述胰腺癌相关疾病状态。
10.在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括通过测量选自在表a(i)至(vi)中定义的组的两种或更多种生物标志物在测试样品中的存在和/或量来确定所述测试样品的生物标志物特征，其中选自在表a(i)至(vi)中定义的所述组的所述两种或更多种生物标志物在所述测试样品中的存在和/或量指示所述个体的所述胰腺癌相关疾病状态。
11.表a
12.生物标志物(和相关uniprot id，如果有的话)
13.部分(i)
14.opg(o00300)/vwf(p04275)
15.部分(ii)
16.gsn(p06396)/hadh2(q99714)
17.部分(iii)
18.igfbp3(p17936)
19.部分(iv)
20.补体因子b(p00751)
21.部分(v)
22.muc16(ca125)(q8wxi7)/fcn2(q15485)/masp2(o00187)
23.部分(vi)
24.补体c4(p0c0l4/5)
25.补体c5(p01031)
26.胱抑素c(p01034)
27.部分(vii)
28.糖类抗原19-9(ca19-9)
29.因此，在一个实施例中，所述方法包括确定测试样品的生物标志物特征，其使得能够实现关于从其获得样品的个体的诊断。
[0030]“胰腺癌相关疾病状态”包含胰腺癌本身的存在以及患有或发展为胰腺癌的风险。具体地，所述胰腺癌相关疾病状态包含不同期的胰腺导管腺癌(pdac)的存在。
[0031]
在具体实施例中，本发明的方法允许：
[0032]
(i)对早期胰腺癌的诊断；和/或
[0033]
(ii)对胰腺癌的诊断(即，早期或晚期)。
[0034]“生物标志物”包含任何天然存在的生物分子或其组分或片段，其测量结果可以提供对胰腺癌诊断有用的信息。因此，在表a的背景下，生物标志物可以是蛋白质或其多肽片段或碳水化合物部分。可替代地，生物标志物可以是编码蛋白质或其部分的核酸分子，如mrna、cdna或循环肿瘤dna分子。
[0035]“诊断”包含确定个体的疾病状态的存在或不存在(例如，确定个体是否患有早期胰腺癌或晚期胰腺癌)。
[0036]“早期胰腺癌”包含或意指包括i期和/或ii期胰腺癌或由其组成的胰腺癌。
[0037]
本发明的方法适用于测试来自疑似患有胰腺癌相关疾病状态或处于发展为胰腺癌相关疾病状态的风险的任何个体的样品。例如，所述个体可以来自具有升高的患有胰腺癌或发展为胰腺癌的风险的以下组之一：
[0038]
(i)具有胰腺癌家族史或某些遗传素质(例如，波伊茨-耶格综合征(peutz-jeghers syndrome))的个体；
[0039]
(ii)诊断为患有糖尿病，例如，新发糖尿病(例如，ii型)的个体，尤其是年龄为50岁或以上的个体；和/或
[0040]
(iii)具有提示或符合胰腺癌的症状，例如上腹部或上背部疼痛、食欲不振、体重减轻、黄疸(皮肤和眼睛发黄，以及小便黄赤)、消化不良、恶心、呕吐和/或极度疲惫(疲劳))的个体。
[0041]
所述个体还可以是患有良性胰腺疾病或胆道疾病，例如急性和慢性胰腺炎、糖尿病、肝病、胰腺囊肿、胆石病和igg4疾病的个体。
[0042]
在另外的或替代性实施例中，所述方法适用于将患有胰腺癌相关疾病状态的个体与未患有胰腺癌但具有提示或符合胰腺癌的症状的个体区分开。例如，患有胰腺癌相关疾病状态的个体可以与其区分开的未患有胰腺癌的个体可以具有良性胰腺疾病或胆道疾病，例如急性和慢性胰腺炎、糖尿病、肝病、胰腺囊肿、胆石病和igg4疾病。
[0043]
因此，在一个实施例中，本发明的方法为检测具有增加的发展为pdac的风险的个体的胰腺异常提供定性结果。
[0044]
在具体实施例中，本发明的方法允许：
[0045]
(a)对早期胰腺癌的诊断；以及
[0046]
(b)对晚期胰腺癌的诊断。
[0047]
有利地，本发明的方法还使得能够区分个体的胰腺癌和慢性胰腺炎。
[0048]“早期胰腺癌(early pancreatic cancer)”(或“早期胰腺癌(early stage pancreatic cancer)”)包含或意指包括i期和/或ii期胰腺癌或由其组成的胰腺癌，例如，如由美国癌症联合委员会(the american joint committee on cancer，ajcc)tnm系统确定的(例如，参见：http://www.cancer.org/cancer/pancreaticcancer/detailedguide/pancreatic-cancer-staging以及《ajcc癌症分期手册(ajcc cancer staging manual)》(第7版),2011,edge等人,施普林格出版社(springer)，所述文献通过引用并入本文)。
[0049]
tnm癌症分期系统基于3条关键信息：
[0050]
·
t描述主要(原发性)肿瘤的大小以及所述肿瘤是否已经在胰腺外部生长并且生长到附近器官中。
[0051]
·
n描述扩散到附近(区域)淋巴结。
[0052]
·
m指示癌症是否已经转移(扩散)到身体的其它器官。(胰腺癌扩散的最常见部位是肝、肺和腹膜—消化器官周围的空间。)
[0053]
数字或字母出现在t、n和m之后，以提供关于这些因素中的每个因素的更多细节。
[0054]
t类
[0055]
tx：无法评估主要肿瘤。
[0056]
t0：没有原发性肿瘤的证据。
[0057]
tis：原位癌(肿瘤局限于胰管细胞的顶层)。(在这一期发现非常少的胰腺肿瘤。)
[0058]
t1：癌症仍然在胰腺内，并且跨度为2厘米(cm)(约3/4英寸)或更小。
[0059]
t2：癌症仍然在胰腺内，但是跨度大于2cm。
[0060]
t3：癌症已经在胰腺外部生长到附近周围组织中但未生长到主要血管或神经中。
[0061]
t4：癌症已经生长超过胰腺进入附近大血管或神经。
[0062]
n类
[0063]
nx：无法评估附近(区域)淋巴结。
[0064]
n0：癌症尚未扩散到附近的淋巴结。
[0065]
n1：癌症已经扩散到附近的淋巴结。
[0066]
m类
[0067]
m0：癌症尚未扩散到远处的淋巴结(除了胰腺附近的淋巴结之外)或远处的器官，如肝、肺、脑等。
[0068]
m1：癌症已经扩散到远处的淋巴结或远处的器官。
[0069]
一旦确定t、n和m类，就将此信息组合以将总期指定为0、i、ii、iii或iv(有时后面跟一个字母)。这一过程被称为期分组。
[0070]
0期(tis，n0，m0)：肿瘤局限于胰管细胞的顶层，并且尚未侵入更深的组织。肿瘤尚未扩散到胰腺外部。这些肿瘤有时被称为原位胰腺癌。
[0071]
ia期(t1，n0，m0)：肿瘤局限于胰腺，并且跨度为2cm或更小(t1)。肿瘤尚未扩散到附近的淋巴结(n0)或远处的部位(m0)。
[0072]
ib期(t2，n0，m0)：肿瘤局限于胰腺，并且跨度大于2cm(t2)。肿瘤尚未扩散到附近的淋巴结(n0)或远处的部位(m0)。
[0073]
iia期(t3，n0，m0)：肿瘤在胰腺外部生长但未生长到主要血管或神经中(t3)。肿瘤尚未扩散到附近的淋巴结(n0)或远处的部位(m0)。
[0074]
iib期(t1-3，n1，m0)：肿瘤局限于胰腺，或在胰腺外部生长但未生长到主要血管或神经中(t1-t3)。肿瘤已经扩散到附近的淋巴结(n1)，但未扩散到远处的部位(m0)。
[0075]
iii期(t4，任何n，m0)：肿瘤在胰腺外部生长到附近的主要血管或神经中(t4)。肿瘤可能扩散到或可能没有扩散到附近的淋巴结(任何n)。肿瘤尚未扩散到远处的部位(m0)。
[0076]
iv期(任何t，任何n，m1)：癌症已经扩散到远处的部位(m1)。
[0077]
可替代地或另外，“早期胰腺癌”(或“早期胰腺癌”)包含或意指无症状胰腺癌。胰腺癌的常见表现症状包含黄疸、腹痛、体重减轻、脂肪痢和新发糖尿病。例如，胰腺癌可以在观察到或可观察到症状(例如，常见症状)之前至少1周，例如，在观察到或可观察到症状之前≥2周、≥3周、≥4周、≥5周、≥6周、≥7周、≥8周、≥3个月、≥4个月、≥5个月、≥6个月、≥7个月、≥8个月、≥9个月、≥10个月、≥11个月、≥12个月、≥18个月、≥2年、≥3年、≥4年或≥5年存在。
[0078]
因此，“早期胰腺癌”(或“早期胰腺癌”)包含具有不足以通过常规临床方法诊断的大小和/或发育期的胰腺癌。例如，“早期胰腺癌”或“早期胰腺癌”包含或意指在通过常规临床方法诊断或可诊断胰腺癌之前至少1周，例如，在通过常规临床方法诊断或可诊断胰腺癌之前≥2周、≥3周、≥4周、≥5周、≥6周、≥7周、≥8周、≥3个月、≥4个月、≥5个月、≥6个月、≥7个月、≥8个月、≥9个月、≥10个月、≥11个月、≥12个月、≥18个月、≥2年、≥3年、≥4年或≥5年存在的胰腺癌。
[0079]
用于临床胰腺癌诊断的当代最佳实践对于本领域技术人员而言将是熟知的，然而对于详细综述，参见ducreux等人,2015,
‘
胰腺癌：针对诊断、治疗和随访的esmo临床实践指南(cancer of the pancreas:esmo clinical practice guidelines for diagnosis,
treatment and follow-up)’《肿瘤学年鉴(annals of oncology)》,26(增刊5):第56卷
–
第68卷，所述文献通过引用并入本文。
[0080]
常规临床诊断(例如，“通过常规临床方法诊断”)包含ct扫描、超声、内窥镜超声、活检(组织病理学)和/或物理检查(例如，腹部和可能的局部淋巴结的物理检查)。在一个实施例中，“常规临床诊断”(等)包含在ducreux等人,2015,见上文中阐述的胰腺癌诊断程序。
[0081]
常规临床诊断(等)可以包含或排除使用存在于体液(如血液、血清、间质液、淋巴液、尿液、粘液、唾液、痰液、汗液)和/或组织中的分子生物标志物。
[0082]
本领域技术人员将理解的是，早期胰腺癌可以是可切除的胰腺癌。
[0083]“可切除的胰腺癌”包含或意指胰腺癌包括(和/或被认为)能够通过外科手术去除(即，是可切除的)的肿瘤或由其组成。例如，胰腺癌可以限于胰腺(即，胰腺癌不延伸超过胰腺和/或尚未转移)。
[0084]
在一个实施例中，早期胰腺癌包括在所有维度上为30mm或更小的肿瘤(即，在此实施例中，患有早期胰腺癌的个体不包括在任何维度上大于30mm的胰腺癌肿瘤)，例如，在所有维度上等于或小于29mm、28mm、27mm、26mm、25mm、24mm、22mm、21mm、20mm、19mm、18mm、17mm、16mm、15mm、14mm、13mm、12mm、11mm、10mm、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm或者等于或0.1mm的肿瘤。可替代地或另外，在所有维度上为30mm或更小的胰腺癌肿瘤在一个维度上为至少2mm。可替代地或另外，在所有维度上为30mm或更小的胰腺癌肿瘤在所有维度上为至少2mm。
[0085]
本领域技术人员将理解的是，本发明的方法通常用于提供初始诊断，例如以鉴定处于患有胰腺癌或发展为胰腺癌的风险的个体，之后可以进行另外的临床研究(如活检测试、体内成像等)以证实诊断。
[0086]“待测试的样品”、“测试样品”或“对照样品”包含取自或源自个体的组织或流体样品，其中所述样品包括内源性蛋白质和/或核酸分子和/或碳水化合物部分。优选地，待测试的样品由哺乳动物提供。最优选地，哺乳动物是人。
[0087]
本发明的方法中的待测试的样品可以是细胞、组织或流体样品(或其衍生物)，其包括以下或由以下组成：血液(分级分离的或未分级分离的)、血浆、浆细胞、血清、组织细胞或同样优选的源自细胞或组织样品的蛋白质或核酸。
[0088]
在一个实施例中，样品是胰腺组织样品。在替代性或另外的实施例中，样品是胰腺细胞的样品。
[0089]
优选地，样品可以是血液或血清样品。
[0090]
在本发明的方法中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量在表a中列出的一种或多种生物标志物，例如在表a中列出的所述生物标志物中的至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种或所有13种生物标志物的存在和/或量。
[0091]
在特定的另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量在表a中列出的六种或更多种生物标志物，例如在表a中列出的所述生物标志物中的至少7种、8种、9种、10种、11种、12种或所有13种生物标志物的存在和/或量。
[0092]
在本发明的方法中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量在表a(i)至(vi)中列出的一种或多种生物标志物，例如在表a(i)至(vi)中列出的所述生物标志物中的至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种或所有12种生物标志物的存在和/或量。
[0093]
在特定的另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量在表a(i)至(vi)中列出的六种或更多种生物标志物，例如在表a(i)至(vi)中列出的所述生物标志物中的至少7种、8种、9种、10种、11种或所有12种生物标志物的存在和/或量。
[0094]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量在表a(i)至(v)中列出的三种或更多种生物标志物，例如在表a(i)至(v)中列出的所述生物标志物中的至少4种、5种、6种、7种、8种或所有9种生物标志物的存在和/或量。
[0095]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下生物标志物中的一种或多种，例如2种、3种、4种、5种、6种、7种或所有8种生物标志物和/或其一种或多种次级靶标的存在和/或量：opg、gsn、igfbp3、补体因子b、muc16、补体c4、补体c5、胱抑素c。
[0096]
任选地，所述一个或多个次级靶标选自以下：vwf、hadh2、fcn2、masp2。
[0097]“次级靶标”包含通过脱靶结合、通过抗体或其它结合剂与除了初级靶标生物标志物之外的一种或多种另外的生物标志物(直接共富集)结合的任何靶标，和/或由于所述一种或多种另外的生物标志物与预期初级靶标生物标志物的相互作用(间接共富集)而通过抗体或其它结合剂结合的一种或多种另外的生物标志物。应注意，初级靶标不需要在生物学或临床上比次级靶标更相关。
[0098]
例如，fcn2和masp2是muc16(1)克隆的次级靶标，因为针对muc16的scfv抗体还被示出为与fcn2和masp2结合(直接共富集)。作为另一个实例，vwf是opg(2)克隆的次级靶标，因为其由相同的scfv抗体结合，这预期是由于opg与vwf形成复合物的能力(间接共富集)。对于那些抗体和其序列的细节，参见表3和4。
[0099]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下生物标志物的存在和/或量：
[0100]
opg、gsn、igfbp3、补体因子b、muc16、补体c4、补体c5和胱抑素c；并且任选地，测量选自以下的一种或多种另外的生物标志物的存在和/或量：vwf、hadh2、fcn2、masp2。
[0101]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量在表a中列出的所述生物标志物中的所有生物标志物的存在和/或量(例如，在蛋白质、mrna和/或ctdna水平下)。
[0102]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下中的两种或更多种的存在和/或量：opg、vwf、gsn、igfbp3、muc16、fcn2、masp2。
[0103]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；和/或(ii)opg和/或vwf。
[0104]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；(iii)igfbp3；和/或(iv)补体因子b。
[0105]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；(iii)补体因子b；(iv)igfbp3；(v)补体c4；(vi)补体c5；(vii)胱抑素c；和/或(viii)muc16、fcn2和/或masp2。
[0106]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；以及(ii)opg和/或vwf。
[0107]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在
和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；(iii)igfbp3；以及(iv)补体因子b。
[0108]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；(iii)补体因子b；(iv)igfbp3；(v)补体c4；(vi)补体c5；(vii)胱抑素c；以及(viii)muc16、fcn2和/或masp2。
[0109]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量vwf、fcn2和/或masp2的存在和/或量。
[0110]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下中的一种或多种的存在和/或量：opg、vwf、gsn、igfbp3、muc16、fcn2和/或masp2。
[0111]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量ca 19-9(糖类抗原19-9)的存在和/或量。具体地，本文所述的方法中的任何方法的实施例可以包括测量ca 19-9的存在和/或量，以及测量在表a(i)至(vi)中列出的生物标志物的任何组合的存在和/或量。ca 19-9可以在与其它生物标志物的测量结果相同或不同的时间进行测量。
[0112]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)排除测量ca 19-9(糖类抗原19-9)的存在和/或量。具体地，本文所述的方法中的任何方法的实施例可以排除测量ca 19-9的存在和/或量。
[0113]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)排除测量补体因子b的存在和/或量。具体地，本文所述的方法中的任何方法的实施例可以排除测量补体因子b的存在和/或量。
[0114]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；以及(iii)ca 19-9。
[0115]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；(iii)补体因子b；以及(iv)ca19-9。
[0116]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；(iii)igfbp3；以及(iv)ca19-9。
[0117]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)opg和/或vwf；(ii)补体因子b；(iii)igfbp3；以及(iv)ca 19-9。
[0118]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)igfbp3；(iii)muc16和/或fcn2和/或masp2；以及(iv)ca 19-9。
[0119]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；(iii)补体因子b；(iv)igfbp3；以及(v)ca 19-9。
[0120]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；(iii)补体因子b；(iv)igfbp3；(v)补体c5；以及(vi)ca 19-9。
[0121]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；(iii)补体因子b；(iv)igfbp3；(v)补体c5；(vi)muc16和/或fcn2和/或masp2；以及(vii)ca 19-9。
[0122]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；(iii)补体因子b；(iv)igfbp3；(v)补体c5；
(vi)胱抑素c；(vii)muc16和/或fcn2和/或masp2；以及(viii)ca19-9。
[0123]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；(iii)补体因子b；(iv)igfbp3；(v)补体c4；(vi)补体c5；(vii)胱抑素c；(viii)muc16和/或fcn2和/或masp2；以及(ix)ca 19-9。
[0124]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)补体因子b；(iii)补体c5；(iv)胱抑素c；(v)补体c4；以及(vi)ca 19-9。
[0125]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)igfbp3；(ii)补体因子b；(iii)补体c5；(iv)胱抑素c；(v)补体c4；以及(vi)ca 19-9。
[0126]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)muc16和/或fcn2和/或masp2；(ii)补体因子b；(iii)补体c5；(iv)胱抑素c；(v)补体c4；以及(vi)ca 19-9。
[0127]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)opg和/或vwf；(ii)补体因子b；(iii)补体c5；(iv)胱抑素c；(v)补体c4；以及(vi)ca 19-9。
[0128]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)补体因子b；(ii)补体c5；(iii)胱抑素c；(iv)补体c4；以及(v)ca19-9。
[0129]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；以及(ii)opg和/或vwf。
[0130]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；以及(iii)补体因子b。
[0131]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；以及(iii)igfbp3。
[0132]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)opg和/或vwf；(ii)补体因子b；以及(iii)igfbp3。
[0133]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)igfbp3；以及(iii)muc16和/或fcn2和/或masp2。
[0134]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；(iii)补体因子b；以及(iv)igfbp3。
[0135]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；(iii)补体因子b；(iv)igfbp3；以及(v)补体c5。
[0136]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；(iii)补体因子b；(iv)igfbp3；(v)补体c5；以及(vi)muc16和/或fcn2和/或masp2。
[0137]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；(iii)补体因子b；(iv)igfbp3；(v)补体c5；(vi)胱抑素c；以及(vii)muc16和/或fcn2和/或masp2。
[0138]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；(iii)补体因子b；(iv)igfbp3；(v)补体c4；(vi)补体c5；(vii)胱抑素c；以及(viii)muc16和/或fcn2和/或masp2。
[0139]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)gsn和/或hadh2；(ii)补体因子b；(iii)补体c5；(iv)胱抑素c；以及(v)补体c4。
[0140]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)igfbp3；(ii)补体因子b；(iii)补体c5；(iv)胱抑素c；以及(v)补体c4。
[0141]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)muc16和/或fcn2和/或masp2；(ii)补体因子b；(iii)补体c5；(iv)胱抑素c；以及(v)补体c4。
[0142]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下的存在和/或量：(i)opg和/或vwf；(ii)补体因子b；(iii)补体c5；(iv)胱抑素c；以及(v)补体c4。
[0143]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量在表a部分(i)和/或部分(ii)中列出的一种或多种生物标志物的存在和/或量。
[0144]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量在表a部分(i)和/或部分(iii)和/或部分(v)中列出的一种或多种生物标志物的存在和/或量。
[0145]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量gsn和opg的存在和/或量。
[0146]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量gsn、opg和igfbp3的存在和/或量。
[0147]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量gsn、opg、补体因子b和igfbp3的存在和/或量。
[0148]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量gsn、opg、补体因子b、igfbp3、补体c4、补体c5、胱抑素c和muc16的存在和/或量。
[0149]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量gsn、opg、igfbp3、补体c4、补体c5、胱抑素c和muc16的存在和/或量。
[0150]
在本文所述的本发明的方面中的任何方面的另外的或替代性实施例中，在步骤(b)中，除了opg的存在和/或量之外，还测量vwf在测试样品中的存在和/或量。
[0151]
在本文所述的本发明的方面中的任何方面的另外的或替代性实施例中，在步骤(b)中，测量vwf在测试样品中的存在和/或量，而不是opg的存在和/或量。在本文所述的本发明的方面中的每个方面的另外的或替代性实施例中，在步骤(b)中，测量opg而不是vwf在测试样品中的存在和/或量。
[0152]
如表3和5中所详述，在本文中称为结合opg的抗体序列也可以与vwf结合。
[0153]
在本文所述的本发明的方面中的任何方面的另外的或替代性实施例中，在步骤(b)中测量opg和/或vwf在测试样品中的存在和/或量被测量由seq id no:36的抗体序列结合的一种或多种蛋白质在测试样品中的存在和/或量替代。优选地，由seq id no:36的抗体序列结合的蛋白质是opg和/或vwf。
[0154]
在本文所述的本发明的方面中的任何方面的另外的或替代性实施例中，在步骤(b)中，除了gsn(凝溶胶蛋白)的存在和/或量之外，还测量hadh2在测试样品中的存在和/或
量。
[0155]
在本文所述的本发明的方面中的任何方面的另外的或替代性实施例中，在步骤(b)中，测量hadh2在测试样品中的存在和/或量，而不是gsn的存在和/或量。在本文所述的本发明的方面中的每个方面的另外的或替代性实施例中，在步骤(b)中，测量gsn而不是hadh2在测试样品中的存在和/或量。
[0156]
如表3和5中所详述，在本文中称为结合gsn的抗体序列也可以与hadh2结合。
[0157]
在本文所述的本发明的方面中的任何方面的另外的或替代性实施例中，在步骤(b)中测量gsn和/或hadh2在测试样品中的存在和/或量被测量由seq id no:20的抗体序列结合的一种或多种蛋白质在测试样品中的存在和/或量替代。优选地，由seq id no:20的抗体序列结合的蛋白质是gsn和/或hadh2。
[0158]
在本文所述的本发明的方面中的任何方面的另外的或替代性实施例中，在步骤(b)中，除了muc16(ca125)的存在和/或量之外，还测量fcn2和/或masp2在测试样品中的存在和/或量。
[0159]
在本文所述的本发明的方面中的任何方面的另外的或替代性实施例中，在步骤(b)中，测量fcn2和/或masp2在测试样品中的存在和/或量，而不是muc16的存在和/或量。在本文所述的本发明的方面中的每个方面的另外的或替代性实施例中，在步骤(b)中，测量muc16而不是fcn2和/或masp2在测试样品中的存在和/或量。
[0160]
如表3中所详述，在本文中称为结合muc16的抗体序列也可以与fcn2和/或masp2结合。
[0161]
在本文所述的本发明的方面中的任何方面的另外的或替代性实施例中，在步骤(b)中测量muc16、fcn2和/或masp2在测试样品中的存在和/或量被测量由seq id no:30的抗体序列结合的一种或多种蛋白质在测试样品中的存在和/或量替代。优选地，由seq id no:30的抗体序列结合的蛋白质是muc16、fcn2和/或masp2。
[0162]
在本文所述的本发明的方面中的任何方面的另外的或替代性实施例中，在步骤(b)中测量一种或多种生物标志物在测试样品中的存在和/或量被测量由一种或多种结合剂结合的一种或多种蛋白质在测试样品中的存在和/或量替代，所述一种或多种结合剂包括在表5和/或表6中描述的抗体序列中的一个或多个抗体序列。
[0163]
在本文所述的本发明的方面中的任何方面的另外的或替代性实施例中，在步骤(b)中测量一种或多种生物标志物在测试样品中的存在和/或量被测量由一种或多种结合剂结合的一种或多种蛋白质在测试样品中的存在和/或量替代，所述一种或多种结合剂包括在表5中定义的抗体序列中的一个或多个抗体序列，具体地seq id no:6、11、13、15、20、30、32和36中的一个或多个。
[0164]
在另外的或替代性实施例中，步骤(b)可以包括以下、由以下组成或排除以下：测量opg的表达。可替代地或另外，步骤(b)包括以下、由以下组成或排除以下：测量vwf的表达。可替代地或另外，步骤(b)包括以下、由以下组成或排除以下：测量gsn的表达。可替代地或另外，步骤(b)包括以下、由以下组成或排除以下：测量hadh2的表达。可替代地或另外，步骤(b)包括以下、由以下组成或排除以下：测量补体因子b的表达。可替代地或另外，步骤(b)包括以下、由以下组成或排除以下：测量igfbp3的表达。可替代地或另外，步骤(b)包括以下、由以下组成或排除以下：测量补体c4的表达。可替代地或另外，步骤(b)包括以下、由以
下组成或排除以下：测量补体c5的表达。可替代地或另外，步骤(b)包括以下、由以下组成或排除以下：测量胱抑素c的表达。可替代地或另外，步骤(b)包括以下、由以下组成或排除以下：测量muc16的表达。可替代地或另外，步骤(b)包括以下、由以下组成或排除以下：测量fcn2的表达。可替代地或另外，步骤(b)包括以下、由以下组成或排除以下：测量masp2的表达。可替代地或另外，步骤(b)包括以下、由以下组成或排除以下：测量ca19-9的表达。
[0165]
因此，在另外的或替代性实施例中，步骤(b)包括以下或由以下组成：测量以下中列出的一种或多种生物标志物的存在和/或量：
[0166]
(i)表a，部分(i)，例如，在表a(i)中列出的生物标志物中的两种生物标志物；和/或
[0167]
(ii)表a，部分(ii)，例如，在表a(ii)中列出的生物标志物中的两种生物标志物；和/或
[0168]
(iii)表a，部分(iii)；和/或
[0169]
(iv)表a，部分(iv)；和/或
[0170]
(v)表a，部分(v)，例如，在表a(v)中列出的生物标志物中的2种或所有生物标志物；和/或
[0171]
(vi)表a，部分(vi)，例如，在表a(vi)中列出的生物标志物中的2种或所有生物标志物；和/或
[0172]
(vii)表a，部分(vii)。
[0173]
应当理解，步骤(b)可以另外包括测量在表a中未列出的一种或多种另外的生物标志物的存在和/或量，其中所述另外的生物标志物可以提供另外的诊断信息。
[0174]
例如，步骤(b)可以包括以下或由以下组成：测量在表1中列出的一种或多种生物标志物的存在和/或量。
[0175]
例如，步骤(b)可以包括以下或由以下组成：测量表1中的生物标志物中的至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种或所有生物标志物的存在和/或量。
[0176]
作为另一个实例，步骤(b)可以包括以下或由以下组成：测量在表2中列出的一种或多种生物标志物的存在和/或量。
[0177]
在本发明的第一方面的一个优选实施例中，步骤(b)包括例如在蛋白质水平下测量在表a中列出的生物标志物中的所有生物标志物的存在和/或量。这种生物标志物特征的使用允许诊断处于任何期的胰腺癌(即，pdac)，包含疾病的早期并且包含区别于健康个体和具有提示或符合胰腺癌的症状的个体。优选地，步骤(b)包括测量ca19-9的存在和/或量。
[0178]
本领域技术人员将理解的是，除了测量来自待测试的个体的样品中的生物标志物之外，本发明的方法还可以包括测量一个或多个对照样品中的那些相同的生物标志物。
[0179]
因此，在一个实施例中，所述方法进一步包括以下步骤或由以下步骤组成：
[0180]
(c)提供来自以下的一个或多个(阴性)对照样品：
[0181]
(i)未患有胰腺癌的个体；和/或
[0182]
(ii)患有良性胰腺疾病和/或胆道疾病，例如慢性胰腺炎或糖尿病，例如新发糖尿病(例如，ii型)的个体；以及
[0183]
(d)通过测量在步骤(b)中测量的所述一种或多种生物标志物在所述对照样品中的存在和/或量来确定所述一个或多个对照样品的生物标志物特征；
[0184]
其中在步骤(b)中测量的所述一种或多种生物标志物在所述测试样品中的存在和/或量不同于在步骤(d)中测量的所述一种或多种生物标志物在所述对照样品中的存在和/或量的情况下，鉴定所述胰腺癌相关疾病状态。
[0185]“不同于对照样品中的存在和/或量”包含所述一种或多种生物标志物在测试样品中的存在和/或量不同于所述一个或多个对照样品的存在和/或量(或表示其的预定义参考值)。优选地，测试样品中的存在和/或量与一个或多个对照样品(或对照样品的平均值)中的存在或量相差所述一个或多个对照样品(例如，阴性对照样品)的至少
±
5％，例如，至少
±
6％、
±
7％、
±
8％、
±
9％、
±
10％、
±
11％、
±
12％、
±
13％、
±
14％、
±
15％、
±
16％、
±
17％、
±
18％、
±
19％、
±
20％、
±
21％、
±
22％、
±
23％、
±
24％、
±
25％、
±
26％、
±
27％、
±
28％、
±
29％、
±
30％、
±
31％、
±
32％、
±
33％、
±
34％、
±
35％、
±
36％、
±
37％、
±
38％、
±
39％、
±
40％、
±
41％、
±
42％、
±
43％、
±
44％、
±
45％、
±
41％、
±
42％、
±
43％、
±
44％、
±
55％、
±
60％、
±
65％、
±
66％、
±
67％、
±
68％、
±
69％、
±
70％、
±
71％、
±
72％、
±
73％、
±
74％、
±
75％、
±
76％、
±
77％、
±
78％、
±
79％、
±
80％、
±
81％、
±
82％、
±
83％、
±
84％、
±
85％、
±
86％、
±
87％、
±
88％、
±
89％、
±
90％、
±
91％、
±
92％、
±
93％、
±
94％、
±
95％、
±
96％、
±
97％、
±
98％、
±
99％、
±
100％、
±
125％、
±
150％、
±
175％、
±
200％、
±
225％、
±
250％、
±
275％、
±
300％、
±
350％、
±
400％、
±
500％或至少
±
1000％。
[0186]
可替代地或另外，相对于对照样品中的平均存在或量，测试样品中的存在或量与对照样品中的平均存在或量相差至少》1个标准偏差，例如，相对于对照样品中的平均存在或量相差≥1.5个、≥2个、≥3个、≥4个、≥5个、≥6个、≥7个、≥8个、≥9个、≥10个、≥11个、≥12个、≥13个、≥14个或≥15个标准偏差。可以使用任何合适的方法来确定标准偏差(例如，直接法、平方和、welford法)，然而，在一个实施例中，使用直接法(即，[样品的平方和减去平均值，除以样品的数量]的平方根)来确定标准偏差。
[0187]
可替代地或另外，“不同于对照样品中的存在和/或量”包含测试样品中的存在或量与对照样品中的量以统计学显著的方式不相关。“与对照样品中的量以统计学显著的方式不相关”意指或包含测试样品中的存在或量与对照样品中的存在或量相关，其中p值》0.001，例如，》0.002、》0.003、》0.004、》0.005、》0.01、》0.02、》0.03、》0.04、》0.05、》0.06、》0.07、》0.08、》0.09或》0.1。可以使用本领域技术人员已知的用于确定p值的任何合适的方法，包含z检验、t检验、斯图登氏t检验(student's t-test)、f检验、曼-惠特尼u检验(mann
–
whitney u test)、威尔科克森符号秩检验(wilcoxon signed-rank test)和皮尔逊氏卡方检验(pearson's chi-squared test)。
[0188]
在另外的或替代性实施例中，与阴性对照样品相比，在步骤(b)中测量的gsn和/或hadh2的量的减少指示个体的胰腺癌相关疾病状态。
[0189]
在另外的或替代性实施例中，与阴性对照样品相比，在步骤(b)中测量的igfbp3的量的减少指示个体的胰腺癌相关疾病状态。
[0190]
在另外的或替代性实施例中，与阴性对照样品相比，在步骤(b)中测量的muc16、fcn2和/或masp2的量的减少指示个体的胰腺癌相关疾病状态。
[0191]
在另外的或替代性实施例中，与阴性对照样品相比，在步骤(b)中测量的opg和/或
vwf的量的增加指示个体的胰腺癌相关疾病状态。
[0192]
在另外的或替代性实施例中，与阴性对照样品相比，在步骤(b)中测量的补体因子b的量的增加指示个体的胰腺癌相关疾病状态。
[0193]
在另外的或替代性实施例中，与阴性对照样品相比，在步骤(b)中测量的补体c5的量的增加指示个体的胰腺癌相关疾病状态。
[0194]
在另外的或替代性实施例中，与阴性对照样品相比，在步骤(b)中测量的补体c4的量的增加指示个体的胰腺癌相关疾病状态。
[0195]
在另外的或替代性实施例中，与阴性对照样品相比，在步骤(b)中测量的胱抑素c的量的增加指示个体的胰腺癌相关疾病状态。
[0196]
在另外的或替代性实施例中，与阴性对照样品相比，在步骤(b)中测量的ca 19-9的量的增加指示个体的胰腺癌相关疾病状态。
[0197]
在一个实施例中，本发明的方法可以进一步包括以下步骤或由以下步骤组成：
[0198]
(e)提供来自患有胰腺癌的个体的一个或多个(阳性)对照样品；以及
[0199]
(f)通过测量在步骤(b)中测量的所述一种或多种生物标志物在所述对照样品中的存在和/或量来确定所述对照样品的生物标志物特征；
[0200]
其中在步骤(b)中测量的所述一种或多种生物标志物在所述测试样品中的存在和/或量对应于在步骤(f)中测量的所述一种或多种生物标志物在所述对照样品中的存在和/或量的情况下，鉴定所述胰腺癌相关疾病状态。
[0201]
因此，本发明的方法可以包括步骤(c)+(d)和/或步骤(e)+(f)。
[0202]“对应于对照样品中的存在和/或量”包含存在和/或量与阳性对照样品的存在和/或量相同；或与一个或多个阴性对照样品(或表示其的预定义参考值)相比更接近一个或多个阳性对照样品的存在和/或量。优选地，存在和/或量在所述一个或多个对照样品(或对照样品平均值)的存在和/或量的
±
40％内，例如，在所述一个或多个对照样品(例如，阳性对照样品)的
±
39％、
±
38％、
±
37％、
±
36％、
±
35％、
±
34％、
±
33％、
±
32％、
±
31％、
±
30％、
±
29％、
±
28％、
±
27％、
±
26％、
±
25％、
±
24％、
±
23％、
±
22％、
±
21％、
±
20％、
±
19％、
±
18％、
±
17％、
±
16％、
±
15％、
±
14％、
±
13％、
±
12％、
±
11％、
±
10％、
±
9％、
±
8％、
±
7％、
±
6％、
±
5％、
±
4％、
±
3％、
±
2％、
±
1％、
±
0.05％内或0％内。
[0203]
可替代地或另外，相对于对照样品中的平均存在或量，测试样品中的存在或量的差异≤5个标准偏差，例如，相对于对照样品中的平均存在或量，≤4.5个、≤4个、≤3.5个、≤3个、≤2.5个、≤2个、≤1.5个、≤1.4个、≤1.3个、≤1.2个、≤1.1个、≤1个、≤0.9个、≤0.8个、≤0.7个、≤0.6个、≤0.5个、≤0.4个、≤0.3个、≤0.2个、≤0.1或0个标准偏差，条件是不同和对应的生物标志物表达的标准偏差范围不重叠(例如，邻接，但不重叠)。
[0204]
可替代地或另外，“对应于对照样品中的存在和/或量”包含测试样品中的存在或量与对照样品中的量以统计学显著的方式相关。“与对照样品中的量以统计学显著的方式相关”意指或包含测试样品中的存在或量与对照样品中的存在或量相关，其中p值≤0.05，例如，≤0.04、≤0.03、≤0.02、≤0.01、≤0.005、≤0.004、≤0.003、≤0.002、≤0.001、≤0.0005或≤0.0001。
[0205]
生物标志物的差异表达(上调或下调)或其缺乏可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来确定。差异表达被确定为至少小于0.05的p值(p＝《0.05)，例如，至少《
0.04、《0.03、《0.02、《0.01、《0.009、《0.005、《0.001、《0.0001、《0.00001或至少《0.000001。例如，可以使用支持向量机(svm)来确定差异表达。
[0206]
在一个实施例中，svm是表7中描述的svm脚本，或从其导出。
[0207]
本领域技术人员将理解的是，差异表达可以涉及单一生物标志物或涉及组合考虑的多种生物标志物(即，作为生物标志物特征)。因此，p值可以与单一生物标志物或一组生物标志物相关。事实上，当单独考虑时，差异表达p值大于0.05的蛋白质当考虑其表达水平与一种或多种其它生物标志物组合时仍然可以用作根据本发明的生物标志物。
[0208]
如在所附实例中例示的，某些蛋白质在组织、血液、血清或血浆测试样品中的表达可以指示个体的胰腺癌。例如，在单个测试样品中某些血清蛋白的相对表达可以指示个体的胰腺癌的存在。
[0209]
在替代性或另外的实施例中，可以将在步骤(b)中测量的所述一种或多种生物标志物在测试样品中的存在和/或量与代表在步骤(d)和/或(f)中的测量结果的预定参考值，即参考阴性和/或阳性对照值进行比较。
[0210]
如上文所详述的，本发明的方法还可以包括在一个或多个阴性或阳性对照样品中，测量在步骤(b)中测量的所述一种或多种生物标志物在测试样品中的存在和/或量。
[0211]
例如，一个或多个阴性对照样品可以来自在获得样品时未患有以下疾病的个体：
[0212]
(a)胰腺癌，例如腺癌(例如，胰腺导管腺癌或管状乳头状胰腺腺癌)、胰腺肉瘤、恶性浆液性囊腺瘤、腺鳞状癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶体癌、未分化癌以及具有破骨细胞样巨细胞的未分化癌；和/或
[0213]
(b)非癌性胰腺疾病或病状，例如急性胰腺炎、慢性胰腺炎和自身免疫性胰腺炎；和/或
[0214]
(c)任何其它疾病或病状。
[0215]
因此，阴性对照样品可以从健康个体获得。
[0216]
同样，一个或多个阳性对照样品可以来自在获得样品时患有以下疾病的个体：胰腺癌，例如腺癌(例如，胰腺导管腺癌或管状乳头状胰腺腺癌)、胰腺肉瘤、恶性浆液性囊腺瘤、腺鳞状癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶体癌、未分化癌以及具有破骨细胞样巨细胞的未分化癌；和/或非癌性胰腺疾病或病状，例如急性胰腺炎、慢性胰腺炎和自身免疫性胰腺炎；和/或任何其它疾病或病状。
[0217]
在本发明的第一方面的一个优选实施例中，所述方法在个体身上重复进行。因此，可以使用来自同一个体的在不同时间采集的样品相对于被测的原始样品来重复步骤(a)和(b)(或重复先前的方法)。此类重复测试可以使得能够评估疾病进展，例如以确定所选择的治疗方案的功效并且(如果适当的话)选择待采用的替代性方案。
[0218]
因此，在一个实施例中，使用在1天至104周之间，例如，在1周至100周之间、1周至90周之间、1周至80周之间、1周至70周之间、1周至60周之间、1周至50周之间、1周至40周之间、1周至30周之间、1周至20周之间、1周至10周之间、1周至9周之间、1周至8周之间、1周至7周之间、1周至6周之间、1周至5周之间、1周至4周之间、1周至3周之间或1周至2周之间采集的测试样品与所使用的先前测试样品来重复所述方法。
[0219]
可替代地或另外，可以使用从来自由以下组成的组的每个时间段采集的测试样品重复所述方法：1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9
周、10周、15周、20周、25周、30周、35周、40周、45周、50周、55周、60周、65周、70周、75周、80周、85周、90周、95周、100周、104周、105周、110周、115周、120周、125周和130周。
[0220]
可替代地或另外，所述方法可以重复至少一次，例如，2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次、21次、22次、23次、24次或25次。
[0221]
可替代地或另外，连续重复所述方法。
[0222]
在一个实施例中，重复所述方法，直到使用本发明的方法和/或常规临床方法在个体中诊断出胰腺癌(即，直到诊断得到证实)。
[0223]
合适的常规临床方法是本领域熟知的。例如，描述于以下文献中的那些方法：ducreux等人,2015,
‘
胰腺癌：针对诊断、治疗和随访的esmo临床实践指南’《肿瘤学年鉴》,26(增刊5):第56卷
–
第68卷；和/或freelove和walling,2006,
‘
胰腺癌：诊断和管理(pancreatic cancer:diagnosis and management)’《美国家庭医生(american family physician)》,73(3):485-492，所述文献通过引用并入本文。因此，可以使用一种或多种选自由以下组成的组的方法来证实胰腺癌诊断：计算机断层扫描(优选地，双相螺旋计算机断层扫描)；经腹超声检查；内窥镜超声检查引导的细针抽吸；内窥镜逆行性胰胆管造影术；正电子发射断层扫描；磁共振成像；身体检查；以及活检。
[0224]
可替代地和/或另外，可以使用用于胰腺癌诊断的已知生物标志物特征来证实胰腺癌诊断。例如，可以用一种或多种生物标志物或诊断方法来诊断胰腺癌，所述一种或多种生物标志物或诊断方法在选自由以下组成的组中进行描述：wo 2008/117067 a9；wo 2012/120288 a2；wo 2015/067969 a2；wo 2017/050939 a2；wo 2017/194613 a2；以及wo 2018/141804 a1。
[0225]
在本发明的方法的一个优选实施例中，步骤(a)包括提供来自待测试的个体的血清样品和/或步骤(b)包括测量所述样品中所述一种或多种生物标志物中的蛋白质或多肽的表达。因此，可以在蛋白质水平下确定样品的生物标志物特征。
[0226]
在此类实施例中，步骤(b)、(d)和/或步骤(f)可以使用能够与在表a中列出的生物标志物(即，蛋白质)结合的一种或多种第一结合剂来进行。本领域技术人员将理解的是，第一结合剂可以包括以下或由以下组成：对蛋白质生物标志物之一具有特异性的单一物种或多个不同物种，所述多个不同物种各自对不同的蛋白质生物标志物具有特异性。
[0227]
在另外的或替代性实施例中，一种或多种第一结合剂包括在表5和/或表6中定义的抗体序列中的一个或多个抗体序列。
[0228]
在另外的或替代性实施例中，一种或多种第一结合剂包括seq id no:6、11、13、15、20、30、32和36的抗体序列中的一个或多个抗体序列。
[0229]
在另外的或替代性实施例中，一种或多种第一结合剂包括seq id no:30、32和36的抗体序列中的一个或多个抗体序列。
[0230]
应当理解，在表5中定义的抗体序列的任何组合可以用于本发明的方法中，例如与可以如上所述测量的生物标志物的不同组合中的每个组合或任何组合相关的组合。
[0231]
合适的结合剂(也称为结合分子)可以基于其与给定靶分子结合的能力选自文库，如以下所讨论的。
[0232]
在一个优选实施例中，至少一种类型的结合剂，并且更典型地所有类型的结合剂，
可以包括抗体或抗体的抗原结合片段或其变体或由抗体或抗体的抗原结合片段或其变体组成。
[0233]
用于产生和使用抗体的方法是本领域熟知的，例如参见《抗体：实验室手册(antibodies:a laboratory manual)》,1988,harlow和lane,冷泉港出版社(cold spring harbor press),isbn-13:978-0879693145,《使用抗体：实验室手册(using antibodies:a laboratory manual)》,1998,harlow和lane,冷泉港出版社,isbn-13:978-0879695446以及《制备和使用抗体：实用手册(making and using antibodies:a practical handbook)》,2006,howard和kaser,crc出版社(crc press),isbn-13:978-0849335280(所述文献的公开内容通过引用并入本文)。
[0234]
因此，片段可以含有可变重(vh)结构域或可变轻(v
l
)结构域中的一个或多个。例如，术语抗体片段包含：fab样分子(better等人(1988)《科学(science)》240,1041)；fv分子(skerra等人(1988)《科学》240,1038)；单链fv(scfv)分子，其中vh和v
l
配偶体结构域通过柔性寡肽连接(bird等人(1988)《科学》242,423；huston等人(1988)《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)》85,5879)以及包括分离的v结构域的单结构域抗体(dab)(ward等人(1989)《自然(nature)》341,544)。
[0235]
例如，结合剂可以是scfv分子。
[0236]
术语“抗体变体”包含任何合成抗体、重组抗体或抗体杂交体，如但不限于通过免疫球蛋白轻链和/或重链可变区和/或恒定区的噬菌体展示而产生的单链抗体分子，或能够以本领域技术人员已知的免疫测定形式与抗原结合的其它免疫相互作用分子。
[0237]
涉及合成保留抗体片段的特异性结合位点的抗体片段的技术的一般综述可以在winter和milstein(1991)《自然》349,293-299中找到。
[0238]
分子文库(如抗体文库(clackson等人,1991,《自然》352,624-628；marks等人,1991,《分子生物学杂志(j mol biol)》222(3):581-97)、肽文库(smith,1985,《科学》228(4705):1315-7)、表达的cdna文库(santi等人(2000)《分子生物学杂志》296(2):497-508))、除了抗体框架(如亲和体)之外的其它支架上的文库(gunneriusson等人1999,《应用与环境微生物学(appl environ microbiol)》65(9):4134-40)或基于适配体的文库(kenan等人,1999,《分子生物学方法(methods mol biol.)》118,217-31)可以用作来源，从所述来源中选择对给定基序具有特异性的结合分子用于本发明的方法中。
[0239]
方便地，可以将结合剂固定在表面上(例如，在多孔板或阵列上)；参见以下实例。
[0240]
在本发明的方法的一个实施例中，步骤(b)、(d)和/或步骤(f)是使用包括能够与所述一种或多种生物标志物结合的第二结合剂的测定进行的，所述第二结合剂包括可检测部分。例如，经固定的(第一)结合剂最初可以用于将蛋白质生物标志物
‘
捕获’在微阵列的表面上，并且然后第二结合剂可以用于检测
‘
经捕获的’蛋白质。
[0241]
第二结合剂可以如上文关于(第一)结合剂，如抗体或其抗原结合片段所述。
[0242]
本领域技术人员将理解的是，在进行步骤(b)之前，测试样品中的所述一种或多种生物标志物(例如，蛋白质)可以用可检测部分进行标记。同样，对照样品中的所述一种或多种生物标志物可以用可检测部分进行标记。
[0243]
可替代地或另外，第一结合剂和/或第二结合剂可以用可检测部分进行标记。
[0244]“可检测部分”包含所述部分是可以被检测并且可以确定所述部分的相对量和/或
位置(例如，阵列上的位置)的部分的含义。
[0245]
合适的可检测部分是本领域熟知的。例如，可检测部分可以选自由以下组成的组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分；酶促部分。
[0246]
在一个优选实施例中，可检测部分是生物素。
[0247]
因此，可检测部分可以是荧光部分和/或发光部分和/或化学发光部分，当暴露于具体条件下时，其可以被检测。例如，荧光部分可能需要暴露于特定波长和强度下的辐射(即，光)以引起荧光部分的激发，从而使荧光部分能够发射可以检测到的特定波长下的可检测荧光。
[0248]
可替代地，可检测部分可以是能够将(优选地，不可检测的)底物转化成可以被可视化和/或检测的可检测产物的酶。合适的酶的实例在下文中关于例如elisa测定更详细地讨论。
[0249]
在另外的替代方案中，可检测部分可以是可用于成像的放射性原子。合适的放射性原子包含用于闪烁扫描法研究的
99m
tc和
123
i。其它容易可检测部分包含，例如，用于磁共振成像(mri)的自旋标记，再次如
123
i、
131
i、
111
in、
19
f、
13
c、
15
n、
17
o、钆、锰或铁。清楚的是，待检测的药剂(例如，本文所述的测试样品和/或对照样品中的所述一种或多种生物标志物和/或用于检测所选择的蛋白质的抗体分子)必须具有足够的适当的原子同位素，以便使可检测部分是容易可检测的。
[0250]
用于检测血清或血浆蛋白的优选测定包含酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)、免疫放射测定(irma)和免疫酶测定(iema)，包含使用单克隆和/或多克隆抗体的夹心测定。david等人在美国专利第4,376,110号和第4,486,530号中描述了示例性夹心测定，所述美国专利特此通过引用并入本文。载玻片上细胞的抗体染色可以用于细胞学实验室诊断测试中熟知的方法中，如本领域技术人员所熟知的。
[0251]
方便地，测定是酶联免疫吸附测定(elisa)，其典型地涉及产生有色反应产物的酶的使用，通常在固相测定中。如辣根过氧化物酶和磷酸酶等酶已经被广泛使用。扩增磷酸酶反应的一种方式是使用nadp作为底物产生nad，所述nad现在充当第二酶系统的辅酶。来自大肠杆菌(escherichia coli)的焦磷酸酶提供了一种良好的缀合物，因为酶不存在于组织中，是稳定的并且产生良好的反应颜色。也可以使用基于如荧光素酶等酶的化学发光系统。
[0252]
elisa方法是本领域熟知的，例如参见《elisa指南(the elisa guidebook)》(《分子生物学方法(methods in molecular biology)》),2000,crowther,胡玛纳出版社(humana press),isbn-13:978-0896037281(所述文献的公开内容通过引用并入本文)。
[0253]
可替代地，经常使用与维生素生物素的缀合，因为这可以通过其与酶连接的亲和素或链霉亲和素的反应而容易地检测到，所述酶连接的亲和素或链霉亲和素以极大的特异性和亲和力与其结合。
[0254]
在一个优选实施例中，步骤(b)、(d)和/或步骤(f)可以使用阵列来进行。
[0255]
阵列本身是本领域熟知的。通常，所述阵列由具有间隔开的(即，离散的)区域(“点”)的线性或二维结构形成，所述区域各自具有形成在固相载体的表面上的有限面积。阵列还可以是珠结构，其中每个珠可以通过分子代码或颜色代码来鉴定或在连续流中鉴定。分析也可以依次进行，其中样品经过一系列斑点，所述一系列斑点各自从溶液中吸附这类分子。固相载体典型地是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚
苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固相载体可以呈以下形式：管、珠、盘、硅芯片、微孔板、聚偏二氟乙烯(pvdf)膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、其它多孔膜、非多孔膜(例如，塑料、聚合物、有机玻璃、硅等)、多个聚合物针或多个微量滴定孔或适用于固定蛋白质、多核苷酸和其它合适分子和/或进行免疫测定的任何其它表面。结合方法是本领域熟知的，并且通常由将蛋白质分子、多核苷酸等共价结合或物理吸附到固相载体的交联组成。通过使用熟知的技术，如接触或非接触印刷、掩模或光刻，可以定义每个斑点的位置。对于综述，请参见jenkins,r.e.、pennington,s.r.(2001,《蛋白质组学(proteomics)》,2,13-29)和lal等人(2002,《今日药物开发(drug discov today)》15；7(18增刊):s143-9)。
[0256]
典型地，阵列是微阵列。“微阵列”包含离散区域密度为至少约100/cm2，并且优选地为至少约1000/cm2的区域的阵列的含义。微阵列中的区域具有典型的尺寸，例如直径，在介于约10-250μm之间的范围内，并且与阵列中的其它区域相隔约同一距离。阵列还可以是宏阵列或纳米阵列。
[0257]
一旦合适的结合分子(如上文所讨论的)被鉴定和分离，本领域技术人员就可以使用分子生物学领域熟知的方法来制造阵列。
[0258]
阵列形式的实例在下文的实例和其中引用的参考文献中进行描述；例如参见，steinhauer等人,2002；wingren和borrebaeck,2008；wingren等人,2005；delfani等人,2016(所述文献的公开内容通过引用并入本文)。
[0259]
因此，在示例性实施例中，所述方法包括：
[0260]
(i)用生物素标记存在于样品(例如，血清)中的生物标志物；
[0261]
(ii)使生物素标记的蛋白质与阵列接触，所述阵列包括固定在其表面上的离散位置处的多个scfv，所述scfv对表a(i)至(vi)中的蛋白质中的一种或多种蛋白质具有特异性；
[0262]
(iii)使所述生物素标记的蛋白质(固定在表面结合的scfv上)与包括荧光染料的链霉亲和素缀合物接触；以及
[0263]
(iv)检测在所述阵列表面上的离散位置处的所述染料的存在，
[0264]
其中所述染料在所述阵列表面上的表达指示所述样品中来自表a的生物标志物的表达。
[0265]
在另外的或替代性实施例中，作为所述方法的一部分，测量ca 19-9的存在和/或量。ca 19-9可以与在表a中定义的其它生物标志物一起测量，或单独测量。例如，ca 19-9可以通过单独的elisa方法来测量。然后，可以将针对ca 19-9的数据与针对在表a中定义的其它生物标志物的数据一起或分开分析，以确定胰腺癌相关疾病状态。
[0266]
在替代性实施例中，步骤(b)、(d)和/或(f)包括测量编码所述一种或多种生物标志物的核酸分子的表达。
[0267]
核酸分子可以是基因表达中间体或其衍生物，如mrna或cdna。
[0268]
因此，在步骤(b)、(d)和/或(f)中测量所述一种或多种生物标志物的表达可以使用选自由以下组成的组的方法进行：南方杂交(southern hybridisation)、北方杂交(northern hybridisation)、聚合酶链式反应(pcr)、逆转录酶pcr(rt-pcr)、定量实时pcr(qrt-pcr)、纳米阵列、微阵列、宏阵列、放射自显影术和原位杂交。
[0269]
例如，在步骤(b)、(d)和/或(f)中测量所述一种或多种生物标志物的表达可以使
用一个或多个结合部分来进行，所述一个或多个结合部分各自能够单独地与编码在表a中鉴定的生物标志物之一的核酸分子选择性结合。
[0270]
方便地，所述一个或多个结合部分各自包括以下或由以下组成：核酸分子，如dna、rna、pna、lna、gna、tna或pmo。
[0271]
有利地，所述一个或多个结合部分的长度为5至100个核苷酸。例如，长度为15至35个核苷酸。
[0272]
应当理解，基于核酸的结合部分可以包括可检测部分。
[0273]
因此，可检测部分可以选自由以下组成的组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分(例如，放射性原子)；或酶促部分。
[0274]
可替代地或另外，可检测部分可以包括放射性原子或由放射性原子组成，所述放射性原子例如选自由以下组成的组：锝-99m、碘-123、碘-125、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、磷-32、硫-35、氘、氚、铼-186、铼-188和钇-90。
[0275]
可替代地或另外，结合部分的可检测部分可以是荧光部分。
[0276]
在另外的实施例中，核酸分子是循环肿瘤dna分子(ctdna)。
[0277]
现在已确立适用于检测ctdna的方法；例如，参见lewis等人,2016,《世界胃肠病学杂志(world j gastroenterol)》22(32):7175-7185，以及其中引用的参考文献(所述文献的公开内容通过引用并入本文)。
[0278]
如上文所详述的，在步骤(a)中(和/或在步骤(c)和/或(e)中)提供的样品可以选自由以下组成的组：未分级分离的血液、血浆、血清、组织液、胰腺组织、乳汁、胆汁和尿液。
[0279]
方便地，在步骤(a)、(c)和/或(e)中提供的样品是血清。
[0280]
通过适当选择表a中的生物标志物中的一些或所有生物标志物，任选地结合一种或多种另外的生物标志物，例如来自表1的一种或多种另外的生物标志物，本发明的方法表现出针对胰腺癌的诊断的高预测准确度。
[0281]
因此，如通过roc auc值确定的，所述方法的预测准确度可以为至少0.50，例如，至少0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98或至少0.99。
[0282]
因此，在一个实施例中，如通过roc auc值确定的，所述方法的预测准确度为至少0.80，或优选地为至少0.83。
[0283]
因此，在另一个实施例中，如通过roc auc值确定的，所述方法的预测准确度为至少0.90，或优选地为至少0.92。
[0284]
在本发明的方法中，在达成诊断之前，在步骤(b)中(和/或在步骤(d)和/或(e)中)获得的
‘
原始’数据经历一个或多个分析步骤。例如，原始数据可能需要相对于一个或多个对照值标准化(即，归一化)。
[0285]
典型地，使用支持向量机(svm)进行诊断，如可从http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html获得的支持向量机(例如，e1071 1.5-24)。然而，也可以使用任何其它合适的方法。
[0286]
支持向量机(svm)是用于分类和回归的一组相关监督学习方法。给定一组训练实例，每个训练实例标记为属于两个类别之一，svm训练算法将建立预测新实例是否属于一个类别或另一个类别的模型。直观地，svm模型是将实例表示为空间中的点，所述实例被映射
成使得单独类别的实例被尽可能宽的明显间隙分开。新实例然后被映射到同一空间中并且基于其落在间隙的哪一侧来预测属于哪个类别。
[0287]
更正式地说，支持向量机在高维或无限维空间中构造可以用于分类、回归或其它任务的超平面或一组超平面。直观地，通过具有到任何类别的最近训练数据点的最大距离(所谓的函数间隔)的超平面来实现良好的分离，因为通常间隔越大，分类器的泛化误差越小。对于关于svm的更多信息，参见例如burges,1998,《数据挖掘与知识发现(data mining and knowledge discovery)》,2:121
–
167。
[0288]
在本发明的一个实施例中，在进行本发明的方法之前，使用来自具有已知疾病状态的个体(例如，已知患有胰腺癌的个体、已知患有急性炎性胰腺炎的个体、已知患有慢性胰腺炎的个体或已知健康的个体)的生物标志物概况来“训练”svm。通过运行此类训练样品，svm能够了解哪些生物标志物概况与胰腺癌相关。一旦训练过程完成，svm然后就能够确定被测试的生物标志物样品是否来自患有胰腺癌的个体。
[0289]
然而，可以通过用必要的训练参数对svm进行预编程来绕过此训练过程。例如，可以基于在表a中列出的生物标志物中的任何或所有生物标志物的测量结果，使用在表7中详述的svm算法，根据已知svm参数进行诊断。
[0290]
本领域技术人员将理解的是，通过训练具有适当选择的数据(即，来自具有已知胰腺癌状态的个体的生物标志物测量结果)的svm机器，可以为在表a中列出的生物标志物的任何组合确定合适的svm参数。可替代地，根据本领域已知的任何其它合适的统计学方法，实例和附图的数据可以用于确定特定的胰腺癌相关疾病状态。
[0291]
优选地，本发明的方法的准确度为至少60％，例如，准确度为61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
[0292]
优选地，本发明的方法的灵敏度为至少60％，例如，灵敏度为61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。本发明的方法的灵敏度可以为至少83％。
[0293]
优选地，本发明的方法的特异性为至少60％，例如，特异性为61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
[0294]
本发明的方法的特异性可以为至少95％。
[0295]“准确度”意指方法的正确结果的比例，“灵敏度”意指所有胰腺癌阳性样品中被正确地分类为阳性的比例，并且“特异性”意指所有胰腺癌阴性样品中被正确地分类为阴性的比例。
[0296]
信号强度可以使用本领域技术人员已知的任何合适的方法进行定量，例如使用array-pro(media cybernetics公司(media cybernetics))。信号强度数据可以被归一化(即，以调整技术变化)。可以使用本领域技术人员已知的任何合适的方法来进行归一化。可替代地或另外，使用经验贝叶斯算法combat(johnson等人,2007)将数据归一化。
[0297]
可以使用本领域熟知的方法，如pca、通过anova进行的q值计算和/或变化倍数计算，对细化数据进行进一步的统计学分析。
[0298]
如上所述，第一(“训练”)数据集可以用于鉴定例如来自表a的生物标志物的组合，以用作用于诊断胰腺癌的生物标志物特征。可以使用已知算法来对训练数据集进行数学分析，以确定最合适的生物标志物特征。然后，可以对照新的(“验证”)数据集来验证给定生物标志物组合(特征)的预测准确度。
[0299]
本领域技术人员将理解的是，所测试的个体可以属于任何种族或地理起源。可替代地，所测试的个体可以属于限定的亚群体，例如基于种族和/或地理起源。例如，所测试的个体可以是高加索人和/或中国人(例如，汉族)。
[0300]
典型地，在步骤(a)、(c)和/或(e)中提供的样品在胰腺癌的治疗(例如，切除、化学疗法、放射疗法)之前提供。
[0301]
在一个实施例中，被测试的个体患有选自由慢性胰腺炎、遗传性胰腺导管腺癌和波伊茨-耶格综合征组成的组的一种或多种病状。
[0302]
待诊断的胰腺癌可以选自由以下组成的组：腺癌、腺鳞状癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶体癌、未分化癌以及具有破骨细胞样巨细胞的未分化癌。优选地，胰腺癌是胰腺腺癌。更优选地，胰腺癌是胰腺导管腺癌，也被称为外分泌胰腺癌。
[0303]
本发明第一方面的一个优选实施例包含在对患有胰腺癌的个体进行阳性诊断之后，向个体提供胰腺癌疗法的另外的步骤(g)。
[0304]
因此，本发明的相关方面提供了一种治疗患有胰腺癌的个体的方法，所述方法包括以下步骤：
[0305]
(a)使用根据本发明的第一方面的方法诊断个体患有胰腺癌；以及
[0306]
(b)用胰腺癌疗法治疗如此诊断的个体(例如，参见thota等人,2014,《肿瘤学(oncology)》28(1):70-4，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。
[0307]
胰腺癌疗法可以选自由以下组成的组：外科手术、化学疗法、免疫疗法、化学免疫疗法、热化学疗法、放射疗法和其组合。例如，胰腺癌疗法可以是ac化学疗法；卡培他滨(capecitabine)和多西他赛(docetaxel)化学疗法cmf化学疗法；环磷酰胺；ec化学疗法；ecf化学疗法；e-cmf化学疗法(epi-cmf)；艾日布林(eribulin)fec化学疗法；fec-t化学疗法；氟尿嘧啶(5fu)；gemcarbo化学疗法；吉西他滨(gemcitabine)吉西他滨和顺铂化学疗法(gemcis或gemcisplat)；gemtaxol化学疗法；伊达比星(idarubicin)脂质体阿霉素(liposomal doxorubicin)丝裂霉素(mitomycin)(丝裂霉素c)；米托蒽醌(mitoxantrone)；mm化学疗法；mmm化学疗法；紫杉醇(paclitaxel)tac化学疗法；泰索帝(taxotere)和环磷酰胺(tc)化学疗法；长春花碱(vinblastine)长春新碱(vincristine)长春地辛(vindesine)以及长春瑞滨(vinorelbine)
[0308]
因此，本发明的另外的方面提供了一种用于治疗胰腺癌的抗肿瘤剂(或其组合)，其中所述抗肿瘤剂的剂量方案是基于本发明的第一方面的方法的结果确定的。
[0309]
本发明的相关方面提供了抗肿瘤剂(或其组合)在治疗胰腺癌中的用途，其中所述
抗肿瘤剂的剂量方案是基于本发明的第一方面的方法的结果确定的。
[0310]
本发明的另外的相关方面提供了抗肿瘤剂(或其组合)在制造用于治疗胰腺癌的药物中的用途，其中所述抗肿瘤剂的剂量方案是基于本发明的第一方面的方法的结果确定的。
[0311]
因此，本发明还提供了一种治疗胰腺癌的方法，所述方法包括向患者施用有效量的抗肿瘤剂(或其组合)，其中有效治疗所述胰腺癌的抗肿瘤剂(或其组合)的量是基于本发明的第一方面的方法的结果确定的。
[0312]
在一个实施例中，抗肿瘤剂包括以下或由以下组成：烷化剂(atc代码l01a)、抗代谢物(atc代码l01b)、植物生物碱或其它天然产物(atc代码l01c)、细胞毒性抗生素或相关物质(atc代码l01d)或另一种抗肿瘤剂(atc代码l01x)。
[0313]
因此，在一个实施例中，抗肿瘤剂包括以下或由以下组成：烷化剂，所述烷化剂选自由以下组成的组：氮芥类似物(例如，环磷酰胺、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、氮芥(chlormethine)、异环磷酰胺、曲磷酰胺、泼尼莫司汀(prednimustine)或苯达莫司汀(bendamustine))、烷基磺酸盐(例如，白消安(busulfan)、曲索舒凡(treosulfan)或甘露舒凡(mannosulfan))、乙烯亚胺(例如，噻替派(thiotepa)、三亚胺醌(triaziquone)或卡波醌(carboquone))、亚硝基脲(例如，卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、链佐星(streptozocin)、福莫司汀(fotemustine)、尼莫司汀(nimustine)或雷莫司汀(ranimustine))、环氧化物(例如，依托格鲁(etoglucid))；或另一种烷化剂(atc代码l01ax，例如，二溴甘露醇(mitobronitol)、哌泊溴烷(pipobroman)、替莫唑胺(temozolomide)或达卡巴嗪(dacarbazine))。
[0314]
在另一个实施例中，抗肿瘤剂包括抗代谢物或由抗代谢物组成，所述抗代谢物选自由以下组成的组：叶酸类似物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)、雷替曲塞(raltitrexed)、培美曲塞(pemetrexed)或普拉曲沙(pralatrexate))、嘌呤类似物(例如，巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、克拉屈滨(cladribine)、氟达拉滨(fludarabine)、氯法拉滨(clofarabine)或奈拉滨(nelarabine))或嘧啶类似物(例如，阿糖胞苷(cytarabine)、氟尿嘧啶(5-fu)、替加氟(tegafur)、卡莫氟(carmofur)、吉西他滨、卡培他滨、阿扎胞苷(azacitidine)或地西他滨(decitabine))。
[0315]
在仍另外的实施例中，抗肿瘤剂包括以下或由以下组成：植物生物碱或其它天然产物，所述植物生物碱或其它天然产物选自由以下组成的组：长春花生物碱(vinca alkaloid)或长春花生物碱类似物(例如，长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨或长春氟宁(vinflunine))、鬼臼毒素(podophyllotoxin)衍生物(例如，依托泊苷(etoposide)或替尼泊苷(teniposide))、秋水仙碱(colchicine)衍生物(例如，地美可辛(demecolcine))、紫杉烷(taxane)(例如，紫杉醇、多西他赛或聚谷氨酸紫杉醇(paclitaxel poliglumex))；或另一种植物生物碱或天然产物(atc代码l01cx，例如，曲贝替定(trabectedin))。
[0316]
在一个实施例中，抗肿瘤剂包括以下或由以下组成：细胞毒性抗生素或相关物质，所述细胞毒性抗生素或相关物质选自由以下组成的组：放线菌素(actinomycin)(例如，更生霉素(dactinomycin))、蒽环霉素或相关物质(例如，阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、阿柔比星(aclarubicin)、佐柔比星(zorubicin)、伊达比星、米托蒽醌、吡柔比星(pirarubicin)、戊柔比星(valrubicin)、氨柔
比星(amrubicin)或匹克生琼(pixantrone))；或另一种细胞毒性抗生素或相关物质(atc代码l01dc，例如，博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)、丝裂霉素或伊沙匹隆(ixabepilone))。
[0317]
在另外的实施例中，抗肿瘤剂包括选自由以下组成的组的抗肿瘤剂或由所述抗肿瘤剂组成：铂化合物(例如，顺铂、卡铂、奥沙利铂(oxaliplatin)、沙铂(satraplatin)或聚铂(polyplatillen))、甲基肼(例如，丙卡巴肼(procarbazine))、单克隆抗体(例如，依地洛单抗(edrecolomab)、利妥昔单抗(rituximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、贝伐单抗(bevacizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、卡妥珠单抗(catumaxomab)或奥法木单抗(ofatumumab))、在光动力/放射疗法中使用的敏化剂(例如，卟吩姆钠(porfimer sodium)、氨基乙酰丙酸甲酯(methyl aminolevulinate)、氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)、替莫泊芬(temoporfin)或乙丙昔罗(efaproxiral))或蛋白激酶抑制剂(例如，伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、达沙替尼(dasatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、尼罗替尼(nilotinib)、坦罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)、帕唑帕尼(pazopanib)、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼(afatinib)、马西替尼(masitinib)或托克拉尼(toceranib))。
[0318]
在仍另外的实施例中，抗肿瘤剂包括选自由以下组成的组的抗肿瘤剂或由所述抗肿瘤剂组成：安吖啶(amsacrine)、天冬酰胺酶(asparaginase)、六甲蜜胺(altretamine)、羟基甲脒(hydroxycarbamide)、氯尼达明(lonidamine)、喷司他丁(pentostatin)、米替福新(miltefosine)、马索罗酚(masoprocol)、雌莫司汀(estramustine)、维甲酸(tretinoin)、米托胍腙(mitoguazone)、托泊替康(topotecan)、噻唑弗林(tiazofurine)、伊立替康(irinotecan/camptosar)、阿利维甲酸(alitretinoin)、米托坦(mitotane)、培门冬酶(pegaspargase)、蓓萨罗丁(bexarotene)、三氧化二砷(arsenic trioxide)、地尼白介素(denileukin diftitox)、硼替佐米(bortezomib)、塞来昔布(celecoxib)、阿那格雷(anagrelide)、奥利默森(oblimersen)、sitimagene ceradenovec、伏立诺他(vorinostat)、罗米地辛(romidepsin)、高三尖杉酯碱(omacetaxine mepesuccinate)、艾日布林或亚叶酸。
[0319]
在一个实施例中，抗肿瘤剂包括以下或由以下组成：一种或多种抗肿瘤剂，例如，本文所定义的一种或多种抗肿瘤剂的组合。用于治疗胰腺癌的组合疗法的一个实例是folfirinox，其由以下四种药物组成：
[0320]
·
fol
–
亚叶酸(甲酰四氢叶酸(leucovorin))；
[0321]
·f–
氟尿嘧啶(5-fu)；
[0322]
·
irin
–
伊立替康；以及
[0323]
·
ox
–
奥沙利铂(乐沙定(eloxatin))。
[0324]
因此，通过组合来自上述方法的某些任选实施例，本发明可以提供一种用于诊断和治疗个体的胰腺腺癌(例如，i期或ii期)的方法，所述方法包括：
[0325]
(a)获得或提供用于人类患者的血清或血浆样品；
[0326]
(b)检测来自表a的生物标志物中的一种或多种(例如，所有)生物标志物在样品中的存在和/或量(例如，通过使样品与一种或多种抗体或其抗原结合片段接触，所述一种或
多种抗体或其抗原结合片段各自对所述生物标志物之一具有特异性并且检测所述抗体或片段与所述生物标志物的结合)；
[0327]
(c)基于所述一种或多种生物标志物在样品中的存在和/或量诊断患者患有胰腺腺癌(例如，i期或ii期)；以及
[0328]
(d)向经诊断的患者施用有效量的化学治疗剂(例如，吉西他滨)；和/或全部或部分地外科手术切除胰腺；和/或施用放射疗法。
[0329]
应当理解，步骤(b)可以例如包括确定在表a中列出的生物标志物中的两种或更多种，例如所有生物标志物在样品中的存在和/或量。此步骤可以包括使用如本文所述的阵列，例如，包括固定在阵列板的表面上的对生物标志物具有特异性的多个scfv。
[0330]
在本发明的任何方面的另外的或替代性实施例中，ca 19-9的存在和/或量可以通过单独的方法来确定，例如，通过酶联免疫吸附测定(elisa)试剂盒。
[0331]
应当理解，步骤(c)可以包括一项或多项另外的临床研究(如测试患者的活检样品和/或体内成像)以便证实或确立所述诊断。
[0332]
应当理解，步骤(d)可以包括施用化学治疗剂和/或外科手术和/或放射疗法的组合。
[0333]
在一个优选实施例中，所述患者被诊断为患有可切除的胰腺腺癌(例如，i期或ii期)，并且步骤(d)包括全部或部分地外科手术去除胰腺(例如，使用惠普尔手术(whipple procedure)去除胰腺头或全胰腺切除术)与化学疗法(例如，吉西他滨和/或5-氟尿嘧啶)的组合。应当理解，所述化学疗法可以在外科手术之前和/或之后施用。
[0334]
在一个实施例中，此类方法允许在疾病的表型呈递之前(即，在可观察到的临床症状发展之前)诊断早期胰腺腺癌。因此，所述方法可以用于诊断无症状患者的胰腺腺癌，尤其是处于发展为胰腺癌的高风险的患者，如具有疾病家族史的患者、吸烟者、肥胖个体、糖尿病患者以及患有慢性胰腺炎、慢性乙型肝炎感染、胆石症和/或相关遗传素质(例如，波伊茨-耶格综合征、家族性非典型性多发性痣黑色素瘤综合征(familial atypical multiple mole melanoma syndrome)、林奇综合征(lynch syndrome)、brca1突变和/或brca2突变)的个体。对此类高风险个体进行有效监测可以实现对胰腺腺癌的早期诊断，并且因此极大地增加存活机会。
[0335]
本发明的另一方面提供了一种用于治疗受试者的胰腺癌相关疾病状态的方法，所述方法包括向受试者施用胰腺癌疗法或由其组成，其中所述受试者具有本发明的指示所述受试者的所述胰腺癌相关疾病状态的存在的生物标志物特征。胰腺癌疗法可以是切除、化学疗法和/或放射疗法。在一个实施例中，胰腺癌疗法包括施用至少一种抗肿瘤剂，如上文所述。
[0336]
所述方法可以进一步包括(例如，在治疗之前)测量选自在表a中定义的组的一种或多种生物标志物(例如，表a中的所有生物标志物)在测试样品中的存在和/或量。所述方法可以包括确定来自受试者的测试样品的生物标志物特征(例如，在治疗之前)，如上文所述。
[0337]
本发明的另一方面提供了一种用于检测生物样品(例如，血清样品)中的或生物样品的(例如，诊断和/或预后价值的)临床显著性的生物标志物特征的方法，所述方法包括如上文关于本发明的第一方面所定义的步骤(a)和(b)。优选地，生物标志物特征包括表a中的
生物标志物中的所有生物标志物或由其组成。
[0338]
与本发明的第一方面相关的本发明的另外的方面提供了一种用于诊断或确定胰腺癌相关疾病状态的方法，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：
[0339]
(a)提供来自待测试的个体的样品；以及
[0340]
(b)通过测量由表5和/或表6中描述的抗体序列中的一个或多个抗体序列结合的一种或多种蛋白质在测试样品中的存在和/或数量来确定所述测试样品的生物标志物特征；
[0341]
其中由在表5和/或表6中描述的抗体序列中的一个或多个抗体序列结合的所述一种或多种蛋白质在所述测试样品中的存在和/或数量指示所述个体的所述胰腺癌相关疾病状态。
[0342]
在替代性或另外的实施例中，步骤(b)包括测量由在表5中描述的抗体序列中的一个或多个抗体序列结合的一种或多种蛋白质在测试样品中的存在和/或量。例如，由一种或多种结合剂结合的一种或多种蛋白质，所述一种或多种结合剂包括seq id no:6、11、13、15、20、30、32和36中的一个或多个。
[0343]
在本文中关于本发明的其它方面描述的所有实施例同样适用于本发明的这个另外的方面。此外，本发明的此方面可以与本发明的第一方面的任何实施例组合。例如，所述方法可以包括在步骤(b)中测量来自表a的两种或更多种生物标志物在测试样品中的存在和/或量，以及测量由一种或多种结合剂结合的一种或多种蛋白质在测试样品中的存在和/或量，所述一种或多种结合剂包括在表5中描述的抗体序列中的一个或多个抗体序列。
[0344]
在一个实施例中，所述方法包括测量由一种或多种结合剂结合的一种或多种蛋白质在测试样品中的存在和/或量，所述一种或多种结合剂包括seq id no:30、32和36的抗体序列中的一个或多个抗体序列。
[0345]
本发明的另外的方面提供了一种用于诊断或确定个体的胰腺癌相关疾病状态的阵列，所述阵列包括用于检测在表a(i)至(vi)中定义的生物标志物中的一种或多种生物标志物在样品中的存在的一种或多种药剂(如上述结合剂中的任何结合剂)，任选地另外包括用于检测ca 19-9的存在的药剂。
[0346]
因此，所述阵列适用于执行根据本发明的第一或后续方面的方法。
[0347]
所述阵列包括能够(单独地或共同地)在蛋白质水平或核酸水平下与在表a中定义的生物标志物中的一种或多种生物标志物结合的一种或多种结合剂。
[0348]
所述阵列可以包括一种或多种，优选地两种或更多种结合剂，其中所述结合剂各自能够与如在第一方面中定义的生物标志物选择性结合。因此，所述阵列可以包括生物标志物特异性结合剂的特定选择或由其组成，其与如在第一方面中定义的生物标志物的任何特定选择相关。
[0349]
在一个优选实施例中，所述阵列包括一种或多种抗体或其抗原结合片段，其能够(单独地或共同地)在蛋白质水平下与在表a中定义的生物标志物中的一种或多种生物标志物结合。例如，所述阵列可以包括能够在蛋白质水平下(共同地)与在表a(i)至(vi)中定义的生物标志物中的所有生物标志物结合的scfv分子，任选地所述阵列可以另外包括用于与ca 19-9结合的药剂。
[0350]
在替代性实施例中，所述阵列包括一种或多种抗体或其抗原结合片段，其能够(单
独地或共同地)与以下生物标志物结合：
[0351]
(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；(iii)补体因子b；(iv)igfbp3；(v)补体c4；(vi)补体c5；(vii)胱抑素c；以及(viii)muc16、fcn2和/或masp2；以及任选地来自表1的一种或多种另外的生物标志物。
[0352]
在另外的或替代性实施例中，所述阵列包括一种或多种能够与ca 19-9结合的抗体或其抗原结合片段。然而，可以单独测量ca 19-9。
[0353]
应当理解，所述阵列可以包括一个或多个阳性和/或阴性对照样品。例如，方便地，所述阵列包括作为阳性对照样品的牛血清白蛋白和/或作为阴性对照样品的磷酸盐缓冲盐水。
[0354]
方便地，所述阵列包括表5中的抗体中的一种或多种，例如全部抗体。
[0355]
有利地，所述阵列包括表6中的抗体中的一种或多种，例如全部抗体。
[0356]
本发明的另外的方面提供了选自在表a中定义的组的一种或多种生物标志物作为用于确定个体的胰腺癌相关疾病状态的生物标志物的用途。
[0357]
在另外的或替代性实施例中，所述用途包括以下生物标志物：
[0358]
(i)gsn和/或hadh2；(ii)opg和/或vwf；(iii)补体因子b；(iv)igfbp3；(v)补体c4；(vi)补体c5；(vii)胱抑素c；以及(viii)muc16和/或fcn2和/或masp2；任选地包含ca 19-19和/或来自表1的一种或多种另外的生物标志物。
[0359]
例如，在表a中定义的生物标志物(例如，蛋白质)中的所有生物标志物可以一起用作用于确定个体的胰腺癌的存在的诊断特征。
[0360]
本发明的另外的方面提供了一种用于诊断或确定个体的胰腺癌相关疾病状态的试剂盒，所述试剂盒包括：
[0361]
(a)根据本发明的阵列，或用于制造所述阵列的组件；以及
[0362]
(b)用于执行如上文(例如，在本发明的第一方面或后续方面中)所定义的方法的指令。
[0363]
本发明的另外的方面提供了如本文(例如，在表a中或具体地在表a(i)至(vi)中)所述的生物标志物的一个或多个结合部分在制备用于诊断或确定个体的胰腺癌相关疾病状态的试剂盒中的用途。因此，在如试剂盒的制备中，可以使用多个不同的结合部分，所述多个不同的结合部分各自靶向不同的生物标志物。在一个实施例中，结合部分是抗体或其抗原结合片段(例如，scfv)，如本文所述。
[0364]
本发明的另外的方面提供了一种治疗个体的胰腺癌的方法，所述方法包括以下步骤：
[0365]
(a)根据在本发明的任何第一方面或后续方面中定义的方法确定胰腺癌相关疾病状态；以及
[0366]
(b)向所述个体提供胰腺癌疗法。
[0367]
例如，胰腺癌疗法可以选自由以下组成的组：外科手术(例如，切除术)、化学疗法、免疫疗法、化学免疫疗法和热化学疗法(见上文)。
[0368]
本发明的另外的方面提供了一种用于操作本发明的方法的计算机程序，例如，用于解释步骤(c)(和随后的表达测量步骤)的表达数据，并且由此诊断或确定胰腺癌相关疾病状态。计算机程序可以是经编程的svm。计算机程序可以记录在本领域技术人员已知的合
iv期；n＝167)与健康对照(n＝221)区分开的0.95的roc auc值。
[0388]
图10：pdac i-ii期对健康对照的分类
[0389]
在盲法验证中，对患有早期(i/ii期)pdac的患者对健康对照的血清样品的分类。已经通过基于多重微阵列的分析与ca19-9评估的组合得到数据。分析得到将早期pdac样品(i/ii期；n＝56)与健康对照(n＝221)区分开的0.93的roc auc值。
[0390]
图11：平均决策值的分布
[0391]
在盲法验证中，pdac(所有期)样品、遗传性/fpc风险组样品(命名为panfam)和健康对照的平均决策值的分布。所述图示出了来自三个亚组中的每个亚组的个体的频率，所述三个亚组被分箱到0.25的决策值区间中。
[0392]
实例1
[0393]
背景
[0394]
胰腺导管腺癌(pdac)是5年存活率小于10％的最具侵袭性的恶性肿瘤之一。弥漫性症状和缺乏用于早期检测的生物标志物通常导致晚期诊断并且解释高死亡率。实现较早pdac检测的生物标志物组将在改善患者管理和存活率方面具有很大的价值。
[0395]
方法
[0396]
利用重组抗体微阵列平台来破译与pdac相关的生物标志物特征。最初，评估针对183个独特靶标的396个单链可变片段(scfv)区分pdac与非pdac对照的能力。数据挖掘后，选择38个scfv以包含在随后的多中心研究中。使用38-plex微阵列来探测由315个pdac(i-iv期)、310个健康对照和488个有症状对照组成的血清样品组(n＝1113)。已经在美国和欧洲的七个参考站点从患者和健康志愿者收集样品。
[0397]
结果
[0398]
使用微阵列数据的生物统计学分析来导出用于检测早期pdac的新的8-plex生物标志物特征。当与ca19-9测定组合时，在roc-auc为0.95的情况下，特征组能够检测早期pdac(i期和ii期)对所有对照(健康的和有症状的)。
[0399]
结论
[0400]
新的8-plex生物标志物特征向已建立的ca19-9生物标志物添加显著的正交信息以允许检测具有高预测性能的早期pdac。这清楚地指出了胰腺癌早期诊断的可能性并且由此增加了可外科手术切除肿瘤的比率。
[0401]
缩写词
[0402]
auc：曲线下面积；cv：变异系数；elisa：酶联免疫吸附测定；ip-ms：免疫沉淀质谱法；lasso：最小绝对收缩和选择算子；mwco：截留分子量；mt-pbs：具有1％乳汁和1％吐温20的pbs；pbs：磷酸盐缓冲盐水；pdac：胰腺导管腺癌；rf：随机森林；roc：接受者工作特性；rt：室温；scfv：单链可变片段；svm：支持向量机；t-pbs：含有0.05％吐温20的pbs
[0403]
简介
[0404]
在这项多中心病例对照研究中，使用immunovia公司(immunovia)的immray
tm
重组抗体微阵列平台与ca19-9测定的组合，分析来自pdac i-iv期患者的血清，以鉴定能够区分i/ii期胰腺癌和临床相关对照的生物标志物特征，所述临床相关对照在二次护理时表现出与早期pdac重叠的惊人症状。
[0405]
在进行胰腺癌诊断之前，患者可能有至少12个月是有症状的(haeno等人,2012；
hippisley cox和coupland,2012；stapley等人,2012)。来自伦敦大学学院(university college london，ucl)的近期研究调查了大型英国初级护理数据库，健康改善网络(health improvement network，thin)。本研究显示，pdac患者在诊断之前平均一年看全科医生多于三次，其中症状如腹痛(39％)、黄胆(36％)、肠习惯改变(30％)或消化不良(21％)(keane等人,2014i；keane等人,2014ii)。目前，通过通常功效和结果较差的多种转介途径来研究疑似患有胰腺癌的患者。
[0406]
通过收集并随后使用适当反映所关注的临床群体的有症状对照样品，旨在使结果的临床可译性最大化。仅基于与健康对照的比较的研究可能导致对所关注的疾病非特异性的生物标志物特征，并且导致不太可能代表在预期临床环境中测试的性能的灵敏度和特异性估计。
[0407]
方法
[0408]
样品收集
[0409]
在2016年与2019年间在美国和欧洲的七个胰腺疾病参考站点收集所有血清样品。在本研究中提供样品的站点是：英国伦敦的伦敦大学学院肝脏和消化健康研究所(ucl institute for liver and digestive health,london uk)；美国匹兹堡的匹兹堡大学胃肠病学、肝病学和营养学分部(university of pittsburgh,division of gastroenterology,hepatology&nutrition,pittsburgh,usa)；美国纽约的纽约大学朗格尼医学中心、珀尔马特癌症中心(new york university langone health,perlmutter cancer center,new york,usa)；美国波士顿的贝斯以色列女执事医学中心(bidmc)、胰腺和肝研究所(beth israel deaconess medical center(bidmc),pancreas and liver institute,boston,usa)；西班牙马德里的拉蒙卡哈尔健康研究所(irycis)(ramon y cajal institute for health research(irycis),madrid,spain)；瑞典韦克舍中心医院输血医学系(central hospital,department of transfusion medicine,sweden)以及瑞典哈兰医院瓦尔贝里输血医学系(hallands hospital varberg,department of transfusion medicine,sweden)。
[0410]
研究群组的人口统计
[0411]
来自ucl的样品包括30个pdac、79个糖尿病对照和409个非糖尿病症状对照。来自匹兹堡大学的样品包括169个pdac和15个健康对照。来自irycis的样品包括44个pdac和50个健康对照。60个pdac样品来自珀尔马特癌症中心，并且12个pdac样品来自bidmc。最后，141个健康对照来自韦克舍的医院，48个健康对照来自瓦尔贝里的医院，并且56个健康对照来自商业来源(folio conversant公司(folio conversant))。
[0412]
从具有提示pdac的相关症状(例如，腹痛和黄胆)但随后被诊断为患有各种良性胰腺疾病和胆道疾病(例如，急性和慢性胰腺炎、肝病、胰腺囊肿、胆石病和igg4疾病)的个体收集有症状对照样品。
[0413]
ca19-9测定
[0414]
使用酶联免疫吸附测定(elisa)试剂盒(canag ca19-9 eia，瑞典哥德堡的富吉瑞必欧诊断公司(fujirebio diagnostics,sweden))来确定血清ca19-9水平。通过内插从在同一测定中生成的参考曲线用已知浓度的参考标准来计算ca19-9的水平。根据制造商的说明书，一式两份地进行所有ca19-9测定。
[0415]
样品生物素化
[0416]
将血清样品用生物素进行标记。简而言之，将血清在pbs中以1:9稀释至大约8g/l的总蛋白浓度，并且用1.1mm ez-link nhs-peg4-生物素(赛默飞世尔科技公司(thermo fisher scientific))进行标记。允许溶液在4℃下反应两小时，并且然后通过添加0.5m tris hcl(ph 8.0)淬灭。将经生物素化的血清样品等分并且储存在-20℃下，直到进一步分析。
[0417]
抗体微阵列生产
[0418]
抗体微阵列由针对33种不同抗原的38个人重组scfv(表1)组成。
[0419]
scfv抗体已经使用严格筛选和选择方案从大型噬菌体展示文库中进行选择，并且都基于已经显示出提供有利的抗原结合性质和高芯片上功能性的支架(steinhauer等人,2002；等人,2016)。另外，使用纯蛋白质、纯蛋白质的混合物以及血清样品验证所选择的抗体的特异性，所述血清样品具有：i)已知水平的靶向分析物；ii)掺有已知水平的特异性蛋白质；和/或iii)耗尽的靶向蛋白。正交方法如质谱法(亲和力下拉实验)、elisa、中尺度发现(meso scale discovery，msd)细胞因子测定、血细胞计数珠测定以及掺加和阻断实验也已经用于评估抗体特异性(等人,2000；ingvarsson等人，2007；wingren和borrebaeck,2008；borrebaeck和wingren,2011；carlsson等人,2011)。
[0420]
在大肠杆菌的周质中产生his标记的scfv，并且使用his multitrap hp 96孔过滤板(通用电气医疗生命科学公司(ge healthcare life science))通过固定的金属亲和色谱法(imac)进行纯化。使用具有7k mwco树脂(赛默飞世尔科技公司)的zeba
tm
自旋脱盐96孔自旋板，将洗脱缓冲液更换为pbs。使用pierce coomassie(布拉德福德(bradford))蛋白测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司)来估计蛋白质浓度。使用8-16％标准tgx无染色凝胶(伯乐公司(bio-rad))通过sds-page来评估蛋白质纯度。使用非接触式打印机(sciflexarrayer sx；scienion公司(scienion))，在黑色maxisorp载玻片(nunc，赛默飞世尔科技公司)上产生抗体微阵列。使用即时点选项和使用一个pdc(玻璃压电分配毛细管)来打印阵列布局。将14个相同的阵列打印在每个载玻片上，分成两列，每列七个阵列。
[0421]
每个阵列由14
×
18个斑点组成，其中斑点到斑点中心距离为300μm并且斑点直径为140μm。每个阵列由六个相同的区段组成。所有scfv以六个斑点复制进行打印，其中每个区段中有一个复制。根据单个克隆的结合性质，芯片上scfv浓度的范围为40至193μg/ml。另外，将若干个斑点位置留空作为“阴性参考斑点对照”，并且将一种参考标志物(经生物素化的bsa)用于指导自动网格比对过程，但不用于任何定量目的。在用于微阵列测定之前，将打印的微阵列载玻片在黑暗中在气候控制室中在22℃和40％相对湿度下储存至少5天。
[0422]
免疫沉淀质谱法(ip-ms)
[0423]
为了验证scfv抗体的靶结合并且鉴定血清中可能的相互作用蛋白，进行亲和下拉测定。简而言之，将经纯化的组氨酸标记的scfv固定在磁性镍珠(magnehis ni颗粒，普洛麦格公司(promega))上。使用每种抗体四个技术复制，并且包含未包被的珠作为阴性对照，以减去与珠的非特异性结合。将scfv包被的珠和对照珠与合并的正常人血清(在pbs中稀释14倍)一起温育20分钟。将珠洗涤三次，以使非特异性结合减弱。
[0424]
将经捕获的蛋白质从珠上洗脱，并且在37℃下用胰蛋白酶消化过夜。通过添加甲酸淬灭胰蛋白酶活性，并且将经消化的样品在speed-vac中干燥。使用ultramicrospin c18
柱(尼斯特集团(nest group))对经干燥的肽进行清洁，并且重悬于0.1％甲酸中以进行lc-ms/ms分析。
[0425]
使用与nanolc系统(赛默飞世尔科技公司)偶联的q-exactive hf-x质谱仪来分析肽池。使用xcalibur软件3.0版来控制和获取来自q-exactive hf-x的数据。使用mascot server(2.4.1版)对所获得的数据进行肽鉴定，以用于针对thisp2数据库的搜索(http://www.peptideatlas.org/thisp/)，并且使用dinosaur通过proteios软件环境(proteios software environment)(http://www.proteios.org)对ms1水平的肽进行定量。
[0426]
专注于所得生物标志物特征，亲和下拉测定鉴定了三个scfv的潜在次级靶标(表3)。相互作用蛋白可以是抗体的脱靶结合的结果(直接共富集)或由于预期靶标与另一种蛋白质的相互作用的结果(间接共富集)(fredolini等人,2019)。因此，血管性血友病因子(vwf)由针对骨保护素(opg)的scfv捕获。据报道，opg能够与vwf形成复合物(shahbazi等人,2007)，其指向共富集的间接途径。此外，显示最初针对hadh2的scfv抗体与凝溶胶蛋白(gsn)结合，并且针对muc16(ca125)的scfv抗体暂时与补体凝集素途径组分无花果酶-2(l-无花果酶；fcn2)和甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2(masp2)结合。
[0427]
微阵列测定
[0428]
通常，在每个微阵列载玻片上分析12个患者样品。虽然样品的定位是随机的，但是pdac和对照样品在载玻片和运行上的分布大致相同。除了疾病状态之外，还基于亚组(例如，期或患有/未患有糖尿病)、性别、年龄组、群组和收集年份对样品进行分层。将每个载玻片上的两个阵列用于对照样品(来自健康个体的血清池)，以用于载玻片归一化目的。在每个测定运行中，两个微阵列载玻片专用于质量控制(qc)目的。
[0429]
将每个微阵列载玻片安装在杂交垫片(肖特公司(schott))中，并且在连续搅拌下，在rt下，用含1％w/v乳汁、1％v/v吐温20的无菌pbs(mt-pbs)封闭2小时。同时，将经标记的血清样品的等分试样在冰上解冻，并且随后在mt-pbs中以1:50稀释。将载玻片用含0.05％吐温20的无菌pbs(t-pbs)洗涤四次，随后将经稀释的血清样品添加到垫片的孔中。
[0430]
在连续搅拌下，将样品在rt下在载玻片上温育2小时。接下来，将载玻片用t-pbs洗涤四次，在连续搅拌下，在rt下在mt-pbs中用1μg/ml链霉亲和素alexa-647(生命技术公司(life technologies))温育1小时，并且再次用t-pbs洗涤四次。最后，将载玻片从杂交垫片上取下，浸入dh20中，并且在n2流下干燥。立即用微阵列荧光扫描仪innoscan 710al(innopsys公司(innopsys))在635nm激光激发波长下使用10μm/像素的分辨率扫描载玻片。
[0431]
数据采集、质量控制和预处理
[0432]
使用内部的专有软件平台immunovia评估系统(ies)进行网格比对和斑点信号定量。使用固定圆方法对斑点信号强度进行定量。
[0433]
每个数据点表示六个复制斑点的中值、减去背景的信号，除非任何复制没有通过所应用的z过滤接受标准并且被标记为位置故障。在这种情况下，排除了表现最差的复制，并且替代地使用剩余复制的中值。使用信号强度的log2值，并且没有对数据进行插补。
[0434]
在下一步骤中，对数据进行归一化。使用归一化方法，通过计算每个微阵列载玻片、每种抗体的归一化因子来处理载玻片到载玻片的变化。这一因子基于应用于整个研究中每个载玻片上相同位置的技术复制(来自健康个体的血清池)的信号。
[0435]
所有计算都是在r环境(r核心团队(2019).r：用于统计学计算的语言和环境(r:
alanguage and environment for statistical computing.)奥地利维也纳的统计学计算r基金会(r foundation for statistical computing,vienna,austria))下完成的。在数据归一化后，通过arrayqualitymetrics r软件包(kauffmann等人,2009；kauffmann和huber,2010)进行离群值检测/去除，所述软件包计算每个阵列的强度分布与汇集数据分布之间的柯尔莫可洛夫-斯米洛夫统计量(kolmogorov-smirnov statistic)。最后，在数据分析之前，将ca19-9的elisa数据(也是log2转化)添加到数据集中。
[0436]
总之，在质量控制和预处理期间，去除来自36名供体的样品，并且最终数据集含有来自1113名个体的数据。
[0437]
数据分析
[0438]
值得注意的是，在本研究中使用的基于38个scfv的微阵列源自包括396种scfv抗体的先前发现运行(表2)。为此，将数据划分为训练集(50％)和测试集(50％)。然后对训练集进行特征选择步骤，并且仅使用测试集评估所选择的生物标志物的预测性能(数据未示出)。
[0439]
通过这种方法，鉴定了38种scfv抗体(针对33种独特蛋白质)作为检测pdac病的候选探针。在当前研究中，目的是通过使用若干个新的独立样品群组来验证这些scfv的有用性，并且尝试进一步精简蛋白质生物标志物的列表。为此，集中于三个主要标准来评估用于预期用途的候选scfv。这三个主要类别是：(i)病例与对照之间的相对表达(变化倍数)的差异；(ii)预测性能；以及(iii)分析性能和稳健性。这已经在预定义部分的数据上完成。
[0440]
因此，首先关于变化倍数(fc)的强度和方向评估了每种scfv抗体。给定抗体的fc是两组(即，pdac和对照)的平均log2转化值之间的差异。其次，使用由随机森林(rf)和最小绝对收缩和选择算子(lasso)算法返回的变量重要性，应用多变量和依赖性特征选择来评估scfv抗体的预测性能。在第三步骤中，就可变性(表示为微阵列测定间和测定内cv值)评估每种scfv抗体，以便选择显示稳健分析性能的探针。另外，为了破译最佳精简的生物标志物特征，去除显示与其它抗体的高水平相关性的scfv以使冗余最小化。
[0441]
随后，使用支持向量机算法(svm)评估所得生物标志物特征的分类性能，并且通过生成各种组比较(例如，pdac对健康对照)的接受者工作特性(roc)曲线来评估结果，并且计算对应的曲线下面积(auc)值。在建立分类模型时，将数据分为包含70％样品的训练集和包含30％样品的测试集。进行了大量的交叉验证，并且计算了每个潜在模型的roc auc、灵敏度和特异性值。针对生物标志物的不同子集并且在向特征中添加和不添加ca19-9的情况下，评估模型的预测性能(表4)。
[0442]
结果
[0443]
重组抗体微阵列是基于固定的抗体衍生物，以便用于在微量液体活检(通常为血清或血浆)中平行分析多种分析物。当前研究基于包括针对33种不同抗原的38个单链可变片段(scfv)的抗体微阵列(表1)。通过如在方法部分中描述的先前发现研究(数据未示出)，这38个scfv已经选自396个scfv库(表2)。如先前所述，本研究中包含的所有scfv抗体建立在支架上，当在微阵列载玻片上保持处于干燥状态时，所述支架显示出显示适当的吸附性质和高功能稳定性(steinhauer等人,2002；等人,2016)。
[0444]
使用来自美国和欧洲的若干个不同站点的1113个血清样品，本研究最充分地了解到目前为止已经进行的用于预测胰腺癌的生物标志物组的最大多中心分析之一。另外，本
研究在两个重要方面不同于先前对胰腺癌的亲和力蛋白质组学研究(例如，wingren等人,2012；gerdtsson等人,2015；mellby等人,2018)。首先，本研究基于完全由信息探针而不是高密度微阵列组成的简化的38-plex微阵列，并且其次，本研究中使用的样品集包含小心地选择的大量(n＝488)有症状对照以代表测试的预期临床使用群体。
[0445]
所生成的微阵列数据允许将生物标志物特征精简至八种独特的蛋白质(表3)。如在方法部分中详细描述的，这是通过评估单独的scfv抗体的fc值、预测性能和分析可变性来完成。图1示出了对应scfv抗体克隆的整个数据集(pdac对所有对照)的火山图。
[0446]
通过生成各种组比较的roc曲线来评估所得到的8-plex特征的分类性能，并且计算对应的auc值。图2-4分别示出了针对pdac对健康对照、pdac对有症状对照和pdac对所有对照的分类的roc曲线。当将8-plex微阵列特征与来自ca19-9测定的数据组合时，获得0.96、0.93和0.94的auc值。
[0447]
最重要的是，当使用8-plex特征与来自ca19-9测定的数据的组合时，计算0.95的roc-auc值，以便用于区分来自患有早期pdac(i/ii期)的患者对所有对照(健康和有症状)的样品(图5)。
[0448]
由于早期pdac对胰腺炎的鉴别诊断可能是特别具有挑战性的(和adsay,2009)，因此继续测试生物标志物特征关于这一亚组分析的分类能力。尽管慢性胰腺炎样品的数量在当前研究中是有限的(n＝56)，但数据表明，在roc-auc为0.92的情况下，慢性胰腺炎可以与早期i/ii期pdac区分开(图6)。
[0449]
讨论
[0450]
在本研究中，已经显示，八种蛋白质的基于重组抗体微阵列的生物标志物特征可以显著改善血清ca19-9分析的预测性能以及增强pdac与在症状上与早期pdac重叠的多种良性疾病之间的区分。重要的是，可以证明通过将蛋白质组学多重分析与ca19-9elisa组合，在roc-auc为0.95的情况下，早期i/ii期pdac患者样品可以与所有对照分离。应当强调的是，这些结果是使用从美国和欧洲的七个不同的胰腺疾病参考站点收集的血清样品(n＝1113)获得的，以避免当使用归档样本时可能发生的来自样品收集、处理和储存的许多潜在偏差(zhang和chan,2005)。
[0451]
唾液酸化路易斯a四糖表位(糖类抗原19-9；ca19-9)是临床上最广泛使用的用于胰腺癌的肿瘤标志物，但是单独地所述表位缺乏对于诊断必需的灵敏度和特异性并且不推荐用于筛选目的。当使用37u/ml的测定截止值时，据报道，ca19-9对胰腺癌的中值灵敏度为81％并且特异性为90％，而将阈值增加到100u/ml使特异性提高到98％，但使灵敏度降低到68％(steinberg,1990)。然而，稍后已经指出，所引用的分析主要涉及健康受试者作为对照，并且因此不反映所关注的临床群体(poruk等人,2013)。当在临床上更相关的背景下重新评估ca19-9的准确度时，在37u/ml的常规临床截止值下，ca19-9的表观功能灵敏度和特异性各自为大约80％。
[0452]
通过将ca19-9测量结果与多参数微阵列分析组合，可以产生svm模型算法，所述算法产生将pdac样品与临床相关对照区分开的95％的特异性和83％的灵敏度。由于ca19-9在许多良性疾病(包含胰腺炎、肝硬化、胆管炎和梗阻性黄疸)中增加，使用相关对照有助于评估潜在pdac生物标志物的临床有用性。在此背景下，可以证明，在roc-auc为0.92的情况下，i期和ii期pdac样品可以与慢性胰腺炎区分开(图6)。此外，观察到与仅使用ca19-9相比，当
从有症状对照中分离pdac时，复合特征使roc-auc值增加大约5％。
[0453]
看到svm模型算法作为在具有较高疾病患病率的患者组中用于发展中胰腺癌的早期检测的辅助手段的巨大适用性。这些高风险人群可以包含：(i)具有胰腺癌家族史或某些遗传素质的个体(singhi等人,2019)；(ii)年龄为50岁以上的晚发糖尿病患者，其在糖尿病的前三年内患有pdac的风险增加至多八倍(chari等人,2005；batabyal等人,2014)；以及(iii)具有模糊但令人担忧的可能提示胰腺癌，如背部和腹部疼痛、黄疸和体重减轻的症状的患者(keane等人,2014i)。
[0454]
总之，针对高风险患者组的pdac的诊断测试具有早期检测出恶性肿瘤的可能性，这可以显著地有助于增加肿瘤可切除性并且由此总体降低癌症特异性死亡率(pelaez-luna等人,2007)。
[0455]
如先前所述，产生最高特异性/灵敏度组合的基于微阵列的生物标志物特征针对八种不同的蛋白质(表3)。先前已经报道，这些蛋白质中的三种蛋白质，即gsn、igfbp3和opg与胰腺癌有关(ni等人,2008；yoneyama等人,2016；shi等人,2014)。在pdac血清样品中观察到opg的表达水平增加，但gsn和igfbp3的水平降低(图1)。这似乎与关于主题的一般文献一致。然而，不同的抗体可能识别不同形式的循环分析物(即，游离的、复合的和片段化的)，因此冲突的结果将不一定是意外的。
[0456]
muc16(ca125)的血清水平是用于卵巢癌的诊断、早期复发的检测以及用于监测治疗的治疗效果的经典肿瘤标志物(felder等人,2014)。关于muc16参与胰腺癌的报道都是非常匮乏的。然而，muc16在ca19-9未升高的胰腺癌的情况下，具体地在路易斯抗原(lewis antigen)阴性的那些患者中似乎具有诊断价值(liu等人,2016)。
[0457]
特征中的若干种补体蛋白(例如，c4、c5和因子b)的存在表明补体系统在胰腺癌中的重要作用。关于补体文献中的癌症相关信息相对较少，但已经认识到补体参与胰腺疾病(bettac等人,2017)。尽管本质上是复杂的，但补体激活通常被认为是针对癌症具有保护性的。fcn2和masp2在特征中的可能参与表明了凝集素诱导的途径在pdac中的新作用。先前已经显示，fcn2与masp2直接相关以触发凝集素补体途径(lacroix等人,2009)。
[0458]
最后，观察到pdac样品中vwf和胱抑素c的血清水平增加(图1)。vwf在血液凝固中起主要作用，并且其可能涉及影响大部分pdac患者的静脉血栓栓塞(vte)问题，这似乎是合理的(faille等人,2018)。胱抑素c是半胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶b的抑制剂，并且是用于评估肾小球滤过率的既定临床标志物(ferguson等人,2015)。然而，胱抑素c先前也与癌症有关，并且在胰液样品的全局蛋白质组学分析中被鉴定为pdac的候选标志物(kos等人,2000；等人,2004)。然而，先前还没有任何建议组合使用此类生物标志物的测量结果来产生用于胰腺癌诊断的特征。
[0459]
总之，结果表明，将来自8-plex重组抗体微阵列测试的数据与ca19-9测定的数据组合可以检测具有高预测性能的源自患有i期和ii期pdac的患者的样品。因此，这清楚地指出了在早期使用血清生物标志物特征诊断胰腺癌的可能性。
[0460]
设想的是，这种测试方案可以容易地用于初级和次级护理的临床医师，以便用于监视高风险群体并且用于诊断具有提示早期胰腺癌的症状的患者。
[0461]
参考文献
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[0509]
表1：38-plex微阵列scfv
[0510][0511][0512]
表2：发现阶段scfv特异性；n＝396
[0513]
[0514]
[0515]
[0516]
[0517][0518]
表3：8-plex生物标志物特征
[0519]
scfv克隆初级靶标uniprot id次级靶标uniprot idc4(3)补体c4p0c0l4/5不适用不适用c5(2)补体c5p01031不适用不适用胱抑素c(1)胱抑素cp01034不适用不适用因子b(2)补体因子bp00751不适用不适用hadh2(3)gsnp06396hadh2q99714igfbp3(2)igfbp-3p17936不适用不适用muc16(1)粘蛋白-16q8wxi7fcn2、masp2q15485、o00187opg(2)opgo00300vwfp04275
[0520]
表4：生物标志物和生物标志物组合的示例性区分能力(pdac对所有对照)。
[0521]
[0522][0523]1和/或hadh2，2和/或vwf，3和/或masp2和/或fcn2
[0524]
表5
–
针对表3中的生物标志物的scfv抗体的氨基酸序列*在等人,2000和等人,2016中描述了scfv构建体的分子架构。
[0525]
[0526][0527]
表6
–
在表1中列出的scfv抗体的氨基酸序列*在等人,2000和等人,2016中描述了scfv构建体的分子架构。
[0528]
[0529]
[0530]
[0531]
[0532]
[0533][0534]
表7：svm脚本
[0535]
[0536]
[0537]
[0538]
[0539][0540][0541]
实例2
hospital)和宾夕法尼亚大学(university of pennsylvania)。欧洲提供样品的站点是瑞典的萨尔格林斯卡医院(sahlgrenska university hospital)和韦克舍中心医院、芬兰的赫尔辛基大学医院(helsinki university hospital)和西班牙的拉蒙卡哈尔大学医院(ram
ó
n y cajal university hospital)。
[0555]
人口统计信息
[0556]
样品分别包括167个pdac(其中56个i期和ii期)、203个遗传性/fpc风险组对照和221个健康对照。对于pdac样品，供体的中值年龄为70岁，对于遗传性/fpc风险组对照中值年龄为59岁，并且对于健康对照中值年龄为49岁。pdac样品的供体的性别分布为58％男性/42％女性，遗传性/fpc风险组的供体的性别分布为36％男性/64％女性，并且健康对照的性别分布为52％男性/48％女性。
[0557]
样品随机化和盲法
[0558]
实验室技术人员、实验室主任和医疗主任对于血清样品是不知道的，直至结果最终确定。另外，样品的顺序在批次内随机化以用于生物素化和微阵列分析，以使分析偏差最小化。
[0559]
ca19-9测定
[0560]
通过cobas e411分析仪(德国曼海姆的罗氏诊断公司(roche diagnostics,mannheim,germany))使用电化学发光免疫测定技术来测量血清ca19-9水平。所有ca19-9测定根据制造商的说明书使用经验证的仪器和定义的sop进行。
[0561]
样品生物素化
[0562]
将血清样品用生物素一式两份地进行标记。简而言之，将血清在pbs中以1:9稀释至大约8g/l的总蛋白浓度，并且用1.1mm ez-link nhs-peg4-生物素(赛默飞世尔科技公司)进行标记。允许生物素化在4℃下进行两小时，并且然后通过添加0.5m tris hcl(ph 8.0)淬灭。将经标记的血清样品等分并且储存在-20℃下，直到进一步分析。
[0563]
抗体微阵列生产
[0564]
抗体微阵列由针对各种肿瘤抗原的八个重组scfv和补体系统组分组成。在大肠杆菌的周质中产生his标记的scfv，并且使用his multitrap hp 96孔过滤板(通用电气医疗生命科学公司)通过固定的金属亲和色谱法(imac)进行纯化。使用具有7k mwco树脂(赛默飞世尔科技公司)的zeba
tm
自旋脱盐96孔自旋板，将洗脱缓冲液更换为pbs。使用pierce coomassie(布拉德福德)蛋白测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司)来估计蛋白质浓度。使用8-16％标准tgx无染色凝胶(伯乐公司)通过sds-page来评估蛋白质纯度。使用非接触式打印机(sciflexarrayer sx；scienion公司)，在黑色maxisorp载玻片(nunc，赛默飞世尔科技公司)上产生抗体微阵列。使用即时点选项和使用一个pdc(玻璃压电分配毛细管)来打印阵列布局。将十二个相同的阵列打印在每个载玻片上，分成两列，每列七个阵列。
[0565]
每个阵列由6x 10个斑点组成，其中斑点到斑点中心距离为350μm并且斑点直径为140μm。每个阵列由三个相同的区段组成。所有scfv以六个斑点复制进行打印，其中每个区段中有两个复制。根据单个克隆的结合性质，芯片上scfv浓度的范围为52至217μg/ml。另外，在每个阵列上，点样了六个阴性对照(pbs)复制和六个参考标志物(生物素化bsa)复制。在用于微阵列测定之前，将打印的微阵列载玻片在黑暗中在气候控制室中在22℃和40％相对湿度下储存至少5天。
[0566]
微阵列测定
[0567]
通常，在每个微阵列载玻片上一式两份地分析六个患者样品。在每个测定运行中，两个微阵列载玻片专用于质量控制(qc)和归一化目的。
[0568]
将每个微阵列载玻片安装在杂交垫片(肖特公司)中，并且在连续搅拌下，在室温(rt)下，用含1％w/v乳汁、1％v/v吐温20的无菌pbs(mt-pbs)封闭2小时。同时，将经标记的血清样品的等分试样在冰上解冻，并且随后在mt-pbs中以1:50稀释。将载玻片用含0.05％吐温20的无菌pbs(t-pbs)洗涤四次，随后将经稀释的血清样品添加到垫片的孔中。
[0569]
在连续搅拌下，将样品在rt下在载玻片上温育2小时。接下来，将载玻片用t-pbs洗涤四次，在连续搅拌下，在rt下在mt-pbs中用1μg/ml链霉亲和素alexa-647(生命技术公司)温育1小时，并且再次用t-pbs洗涤四次。最后，将载玻片从垫片上取下，浸入水中，并且在n2流下干燥。立即用微阵列荧光扫描仪innoscan 710al(innopsys公司)在635nm激光激发波长下使用10μm/像素的分辨率扫描载玻片。
[0570]
数据采集、归一化和质量控制
[0571]
数据采集、归一化和质量控制由内部专有软件平台immunovia评估系统ldt(ies ldt)自动生成。更详细地，使用固定圆方法进行网格比对和斑点信号定量。
[0572]
每个数据点表示六个复制斑点的中值、减去背景的信号，除非任何复制没有通过所应用的z过滤接受标准并且被标记为位置故障。在这种情况下，排除了表现最差的复制，并且替代地使用剩余复制的中值。使用信号强度的log2值，并且没有对数据进行插补。
[0573]
通过自动计算每种scfv抗体的每个微阵列测定批次的归一化因子来处理批次间的差异。这些因子是基于置于专用qc载玻片上的六个血清池(分别是来自健康个体的三个血清池和来自pdac患者的三个血清池)的信号。
[0574]
在归一化之前和之后自动应用若干个质量控制(qc)步骤，并且仅对通过qc步骤的样品进行进一步评估。总的来说，将单个样品去除，并且最终数据集含有来自591个个体的数据。
[0575]
将ca19-9测定数据添加到数据集中，并且基于8-plex生物标志物特征和ca19-9值自动计算就每个患者样品的决策值(dv)而言的样品结果。将结果自动上传到orchard harvest实验室信息系统(orchard软件公司(orchard software corporation))以进行非盲法和最终结果验证。
[0576]
数据分析
[0577]
使用预定义和锁定的模型算法以及用于样品分类的dv截止值来计算灵敏度、特异性以及阳性和阴性预测值(分别是ppv和npv)。使用先前建立和锁定的模型算法，计算不同诊断组的接受者工作特性(roc)曲线和对应的曲线下面积(auc)值。
[0578]
结果
[0579]
总共58个样品落在模型算法的定义的dv边界范围内，并且无法被分配分类。成功地对所有其它样品进行测定和分类。这使得144个pdac(其中46个i期和ii期)、183个家族性/遗传性对照和206个健康对照在研究完成和样品信息揭盲之后进行分析。
[0580]
通过生成各种组比较的roc曲线来评估验证研究的结果，并且当将来自8-plex微阵列分析的数据与来自ca19-9测定的数据组合时，计算对应的auc值。图7-8示出了相对于属于遗传性/fpc风险组的对照，用于分类pdac所有期(i-iv)的auc值为0.94并且pdac早期
(i/ii)的auc值为0.92。应用预定义的模型截止值，对于包含pdac的所有期的比较，实现了87％的灵敏度和98％的特异性，并且最重要的是，数据产生85％的灵敏度和98％的特异性，用于将早期pdac患者与处于遗传性或fpc(但目前没有恶性疾病)的风险的个体区分开(表8)。
[0581]
表8：盲法验证研究的结果
[0582]
pdac对家族性/遗传性对照i期和ii期pdac所有期pdac灵敏度84.8％86.8％特异性98.4％98.4％npv(3％患病率)99.5％99.6％ppv(3％患病率)62.1％62.7％npv(1％患病率)99.8％99.9％ppv(1％患病率)34.9％35.4％
[0583]
图9-10示出了用于将pdac样品与健康对照(hc)区分开的对应roc曲线和auc值。0.95(pdac i-iv期对hc)和0.93(pdac i/ii期对hc)的auc值与在测试发展期间已经观察到的结果具有良好的一致性(mellby等人,2018)。
[0584]
此外，已经评估了测试的阳性和阴性预测值(ppv和npv)(表8)。ppv和npv通过疾病患病率与灵敏度和特异性有关(trevethan,2017)。根据特定的遗传综合征或被诊断为患有pdac的一级亲属的数量，对于处于遗传性/fpc的风险的群体的患病率为1-3％不等。在表8中，示出了分别在1％和3％的患病率下测试的ppv和npv的计算结果。在3％的患病率下，用于检测早期(i/ii)pdac的ppv为62％。由于ppv与患病率成正比，因此值显著低于1％。在两个患病率水平下，用于检测早期(i/ii)pdac的npv都很高(99.5％和99.8％)。
[0585]
图11示出了分别来自pdac患者、处于遗传性或家族性胰腺癌的风险的个体和健康供体的样品的决策值的分布。dv是测试模型的输出评分，所述输出评分结合截止值将通知患者样品针对pdac是阳性还是阴性的。有趣的是，pdac与其它两组之间存在明显的区别，但在处于遗传性或家族性胰腺癌的风险的个体与健康供体之间存在显著的重叠，但是风险组中的个体的总体健康状态更差。对于患有pdac的患者，存在可以反映不同期的存在和疾病的遗传异质性质的决策值的广泛分布(juiz等人,2019)。
[0586]
讨论
[0587]
近年来，对pdac患者的种系遗传测试和家族史分析的益处的认识不断增加，以帮助鉴定高风险个体(广义地定义为终身风险大于5％的个体)。对于基于群体的筛选，发展为胰腺癌的总体平均终身风险太低(美国为大约1.6％)。作为比较，对于具有受疾病影响的两个一级亲属的个体，发展为胰腺癌的所估计的终身风险为约8％(klein等人,2004)。鉴定高风险个体提供了在潜在治愈期检测pdac的机会。
[0588]
然而，目前还没有关于哪些患者和个体组应当符合胰腺监视和筛选的一般协议。在2020年，基于49名多学科专家的临床经验，胰腺癌筛选(caps)联盟发布了胰腺癌筛选的共识指南的更新版(goggins等人,2020)。联盟建议在以下高风险人群中进行筛选：具有至少一名患有胰腺癌的一级亲属(所述亲属进而还具有患有胰腺癌的一级亲属)的个体、患有波伊茨-耶格综合征的所有患者、种系cdkn2a突变的所有携带者以及具有至少一名受影响的一级血亲的种系brca1、brca2、palb2、atm、mlh1、msh2或msh6基因突变的携带者。
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