利用移动磁铁分散磁性粒子的制作方法

1.本发明涉及一种分散磁性粒子的方法，所述方法包括或由以下步骤组成：(a)在容器中，将至少一种永磁体和所述磁性粒子在液相中结合；以及(b)利用磁场触发所述永磁体的波动或振荡运动；从而分散所述粒子。
2.在本说明书中，引用了包括专利申请和制造商手册在内的许多文献。尽管这些文件所披露的内容与本发明的专利性无关，但其全部内容在此引入作为参考。更具体地说，所有参考文献都以引用方式并入本文，程度犹如每份单独文献均明确、单独指明以引用方式并入。


背景技术：

3.磁性分离技术已经公认并普遍应用于化学、生物科学和诊断等应用中。该方法依靠在悬浮环境中对功能化纳米进行选择性分散或磁化，使之尺寸达到微米级的顺磁性或铁磁性粒子。当粒子分散时，可以应用平衡、绑定、反应、洗涤或洗脱条件。在磁化阶段，粒子和上层清液可以分离。
4.这些方法的优点包括体积不受限制、实施方案可用作直接批量的方法、在即使存在诸如细胞残余的粗杂质的情况下，依然适用。无论目标材料如何，例如，对固体材料进行简单添加和清除，尤其适合于目标dna分子可能极大的dna富集。此外，几乎不需要手工操作，也不需要耗时的离心步骤。易于防止潜在的交叉污染，也易于自动化的特性，使得磁性分离技术成为从低到高通量应用的理想选择。
5.无论何种应用，都必须进行粒子的磁性分离，通常要重复进行。通常，绝大多数手动和大多数自动方法利用强永磁体，将强永磁体暂时放置在容纳磁性粒子的容器(通常为5μl至50ml范围内的聚合物反应管)的外表面附近。粒子被磁化并聚集在磁场最强点附近。这将使磁化粒子脱离分散状态，进入聚集或集合状态。如果是非常小的粒子，通常需要利用更强的磁体和/或花费更多时间完成粒子收集，从而大体上完全回收粒子。这个聚集步骤依赖磁力将粒子吸引到磁场。为了重新分散粒子，可将磁体移离容器(从而移离粒子)，通过上下移液或摇晃等混合步骤，可以再次分散粒子。
6.非永磁体也可以用作磁性分离器。值得注意的是，perkinelmer的chemagic平台(perkin elmer chemagen technologie gmbh)利用了瞬时磁化棒系统。本文中，电磁体用于处理更大体积的粒子，并且电磁体直接浸没在包含磁性粒子的溶液中(chemagic magnetic separation module i(《10ml)；system 8l
×
(7ml)。
7.所有这些系统都有一个共同特征，即使用物理运动来引入或移动、清除磁化源，使其分别朝向和远离磁性粒子。上述chemagic平台虽然使用别的方法进行磁性分离，但需要将瞬时磁化棒引入样品中，这可能会导致交叉污染。此外，利用不同相关技术手段单独混合和分散程序这一要求，与上文进一步讨论的现有技术方法具有共同特征，这些现有技术方法使用的是完全在反应容器外部的磁体。


技术实现要素：

8.鉴于现有技术的缺点，可见本发明的根本技术问题在于提供磁性粒子处理的改进装置和方法。与此相关、并且取决于具体设想应用的是，该技术问题也可以看作是分离或合成的改进装置和方法的提供，更具体地说，是通过磁性方式的分离或合成。
9.这一问题由权利要求的主旨事项予以解决。
10.因此，在第一方面，本发明提供了一种分散磁性粒子的方法，所述方法包括或由以下步骤组成：(a)在容器中，将至少一种永磁体和所述磁性粒子在液相中结合；以及(b)利用磁场触发所述永磁体的波动或振荡运动；从而分散所述粒子。
11.液相中的磁性粒子通常由于重力而沉降。这不利于与所述液相中成分的相互作用。为此，需要保持粒子悬浮，实现与整个液相的有效表面接触。这称为“分散”，通常使用摇晃、涡旋或上下移液等机械方法来实现。本发明通过所述永磁体的波动或振荡运动来实现分散。
12.磁性粒子(通常称为磁性微粒、磁性纳米粒子、磁珠、磁性微球、顺磁性、亚铁磁性或铁磁性珠)是响应磁场的粒子。通常粒子是顺磁性或铁磁性的。
13.现有技术中已知许多功能化磁性粒子。功能化可以局限于粒子的表面，或者举例而言，一俟出现多孔粒子，可以延伸至孔内表面。
14.功能化使得磁性粒子能够在触发或不触发所述材料化学改性的情况下与粒子附近的材料相互作用。换句话说，在例如目标分析物和磁性粒子某个部分之间，可能存在非共价相互作用。这在下文中也称为“绑定”。另一方面，磁性粒子可以配有某些部分，能够触发化学反应，形成新的化学化合物。在本说明书中，这称为“产物”或“加合物”的形成。
15.优选的功能化，即绑定至磁性粒子的优选部分，将在下面进一步披露的优选实施方式中讨论。
16.就尺寸而言，磁性粒子的直径，优选为在1nm至1mm之间或者100nm至60μm之间。优选地，对于磁性粒子的给定选择，粒子的尺寸呈窄分布。同样，优选具有化学惰性的粒子。这可以通过涂层来实现。此外，过去一直存在物理稳定性的问题。因此，优选在正常使用条件下不分裂的粒子。包含在磁性粒子中的磁性材料也可以嵌入到诸如二氧化硅或聚合物的基质中。这也是一种赋予化学和/或物理稳定性的方法。
17.通常会使用大量的磁性粒子。实际数量取决于所选的应用及其规模。典型值在每个容器100至100000个粒子之间，如1000至10000个。
18.在使用之前，磁性粒子优选处在平衡状态。如果使用由下文一位制造商提供的磁性粒子，可以遵循制造商指南进行平衡。一般来说，平衡意味着将粒子悬浮在缓冲液等水溶液中。
19.所述组合可以同时发生或者以任意顺序发生。
20.所述液相没有特别限制。实施方案包括含有一种或多种目标化合物或分析物的样品或混合物。分析物可能属于不同类别。例如，蛋白质组会是一组分子集合，具有蛋白质性质。术语“液相”包括溶液和悬浮液。
21.除了目标分子之外，样品还可以包含其他材料。其他材料可以是预期清除的污染物。另一方面，液相也可以是纯的：可以是目标化合物的溶液，除了目标化合物和溶剂之外，不含其它成分。
22.液相的一个关键特征在于它提供了一种环境。在该环境中，在所述磁性粒子当中，更具体说，是所述粒子表面部分，与所述液相中的任何目标分析物或化合物之间可能发生相互作用。
23.磁性粒子应用广泛，应用范围包括分析物纯化和固相合成。为了优化过程产率，将包含分析物或起始材料的反应混合物与所述粒子一起混合，这通常通过上下移液、摇晃或涡旋来完成。
24.出乎本发明人意料，他们发现，向反应混合物中添加至少一个永磁体，并通过磁场触发所述永磁体的运动是一种既有效又方便的混合手段，并且具有许多明显优点，所述磁场由另一个磁体产生，所述另一个磁体则位于容纳反应混合物的容器之外。
25.值得注意的是，现有技术方法也使用磁体来处理磁性粒子，即将它们收集在容器内部的一个或几个限定位置，从而可以清除包含尚未绑定物质的剩余液体。然而，现有技术方法不使用磁体进行混合。相反地，在混合阶段，磁铁不存在。
26.同样地，本发明对本技术的贡献在于，使用一种元件，即一种磁体，位于容纳带磁性粒子反应混合物的容器之内，除了用于收集粒子以外，还特别用于混合反应混合物。
27.与上下移液或摇晃相比，使用磁体进行混合还使得混合过程效率更高：永磁体作波动或振荡运动，使液体反应混合物的流动(在流变学意义上)变得更加剧烈。此外，磁性粒子和所述永磁体之间的吸引力导致磁性粒子的运动，该运动与液体运动不同相。值得注意的是，由外部磁体施加的磁力与现有技术的混合过程有异，因此具有上述优点。
28.在本文所附的实施例中，随后质谱分析中鉴定的肽数量用于评估该方法的性能。如该实施例所示，本发明的表现至少与常规磁性粒子处理同样好，同时具有上述优点。
29.上述披露的容器没有特别限制。
30.实用容器包括通常用于分子生物学和体外诊断领域的容器。这些容器通常不含或基本不含污染物，具有化学惰性，和/或表面绑定能力低。
31.在本发明的语境中，容器必须具有至少一个不屏蔽磁场的壁。优选地，整个容器由不屏蔽磁场的材料制成。合适的材料包括塑料、聚丙烯等聚合物、玻璃和陶瓷。牢记对磁导率的要求，也可以使用金属。
32.示例性和优选的容器配置为体积在5μl至1l之间，优选配置在10μl至50ml之间，更优选配置为30μl、40μl、100μl、150μl、200μl、250μl、500μl、1ml、1.5ml、2ml、5ml、15ml和50ml各种体积当中的任何一种的容器。
33.容器可以排列成阵列，如常见形式(例如具有6、24、96、384或1546个孔的一维或二维阵列)。
34.容器也可以实施为微流体设备实施，即包括一个或多个带开口的微缩设备，可选地加宽、带容器和/或阀门。
35.术语“容器”还包括带封闭底部的容器、带盖子的容器、带封闭底部和盖子的容器、完全封闭或密封的容器、管状元件和带至少两个开口使得液相连续流过的元件。此外，在这种流通式容器或反应器中，所述至少一个永磁体及其运动由磁场控制。
36.优选地，所述磁场由所述容器外部的磁体产生。外部磁体可以以多种方式实现，更多详情见下文。一般来说，重点是磁场能够触发位于容器内部的永磁体的波动或振荡运动。这可以通过在容器位置处随时间变化的磁场来实现。这种随时间的变化可以通过在空间中
产生磁场的元件的移动来实现。可选择地或另外地，这可以通过随时间改变磁场生成参数来实现，例如随时间改变流过线圈等电导体的电流。
37.因此，所述磁场可以由电磁体产生，其中流过所述电磁体的电流随时间发生变化，使得至少一个永磁体在所述磁场的影响下进行例如混合所需的波动或振荡运动。
38.磁场也可以由永磁体产生，考虑到至少一个永磁体在容器内部，则在这种情况下，所述永磁体是另一个永磁体，。该外部永磁体可以在三维空间中运动，结果是由所述外部永磁体在容器位置处产生的磁场随时间而改变，再次用于产生所述波动或振荡运动。
39.永磁体是一块亚铁磁性或铁磁材料。
40.单个磁体的尺寸可能差别很大。就容器内部的永磁体而言，可以根据容器尺寸，或者等效地根据所使用的反应器，进行适当的选择。
41.就相对尺寸而言，优选永磁体的最大尺寸要能穿过所述反应器或容器中的最小通道或横截面。优选地，小于最小尺寸是指所述容器的所述最小尺寸或横截面的2/3、1/2、1/3、1/4或10％。这种设置通常可以为自由运动或基本自由运动提供必要条件。优选地，自由或基本自由的运动围绕或沿着至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或优选所有六个平移和旋转运动的轴发生，并且优选地，其中所述自由或基本自由的运动包括沿着至少两个轴的平移。
42.出于解释的目的，点状物体有三个运动自由度，即在三维空间三个独立方向上的平移。对于扩展物体，还有三个自由度，可以用三个独立的旋转轴来定义。
43.为了完整起见，本文给出的实用永磁体尺寸的典型值在0.1mm和10cm之间，如0.2mm和2cm之间，包括下列值和范围中的任何一个：0.3cm、0.4cm、0.5cm、0.6cm、0.7cm、0.8cm、0.9cm和1cm。这些优选尺寸和尺寸范围适用于本文考虑的任何永磁体，也适用于使用多个磁体的实施方案。通常，这些长度指的是所述永磁体的最大延伸长度。
44.可选择地，也可以使用多个永磁体，诸如以上定义的永磁体。典型性但非限制性的数量在一位数和两位数范围内，如2、3、4、5、6、7、8、9和10，亦可使用大于10，如20、30、40或50个磁体。这些数字指的是一个容器，一俟出现使用容器排列(如微量滴定板)亦然。
45.应当理解，永磁体的数量在规定范围内是有限的。换句话说，虽然第一方面的方法可以包括其他措施，但是这不意味着需要比明确指定更多的永磁体。
46.如此多个磁体的磁铁可以彼此相同或不同。
47.就使用多个磁体而言，这同样适用于一般的磁体。举一个具体的例子，单个磁体可以与单个铁磁珠或亚铁磁珠组合。这提供了更严格的磁体运动，同时控制磁场的参数保持不变。另见下文。
48.实现更严格运动的另一种方法是添加一个或多个诸如2、3、4、5、6、7、8、9或10个由非磁化材料如非磁性金属制成的珠。特别优选的是一个和/或多个这样的珠粒具有与永磁体相同或相当的尺寸。
49.就所述永磁体的形状而言，没有特别的限制，优选那些不会负面干扰磁体自由运动的形状。典型形状包括棒、条、杆、圆端杆、立方体、长方体、棱柱、球体、细长和扁椭球体、圆盘、四面体、八面体、十二面体和二十面体。
50.在另一优选实施方式中，(a)所述永磁体包括或者由铁磁材料或亚铁磁材料组成；和/或(b)所述磁体和/或所述粒子经过涂覆，优选用以下涂层涂覆：(i)赋予化学稳定性的
涂层；(ii)赋予机械稳定性或硬度的涂层；(iii)具有催化剂的涂层；(iv)核酸涂层，如探针和/或引物；(v)具有螯合剂如imac、tio2和zro2的涂层；(vi)具有色谱材料的涂层，优选(1)反相基团，如c18、c8、苯；(2)亲水基团，如羟基；(3)阳离子交换基团，如磺酸、磷酸、羧酸；(4)阴离子交换基团，如伯、仲、叔和季氨基；以及(5)(1)至(4)中任一项的任意组合；(vii)具有配体绑定蛋白和/或其同源配体的涂层；优选球蛋白，特别是免疫球蛋白；抗原，优选能够绑定免疫球蛋白的抗原；链霉亲和素、生物素；蛋白a，蛋白g；膜联蛋白v，磷脂；酶，如氧化还原酶、转移酶、连接酶(如聚合酶、水解酶(如蛋白酶、肽酶、核酸酶、糖酶、脂肪酶、裂解酶和异构酶))；脂类；以及(viii)(i)至(vii)中任一项的组合。
51.适合用于所述永磁体的材料包括以下元素及其合金：钕-铁、钕-铁-硼(例如nd2fe
14
b)、钴、钆、铽、镝、铁、镍、氧化铁、锰-铋、锰-锑、锰-砷、钇-铁氧化物、氧化铬、氧化铕和钐-钴。特别优选的材料是钕-铁和钐-钴。
52.符合(c)(i)的合适涂层包括聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚对二甲苯、氮化钛、聚酰亚胺、氯聚合物和含氟聚合物，优选聚四氟乙烯(ptfe)。
53.所述至少一个永磁体将执行波动或振荡运动，所述运动优选由波动或振荡磁场触发，所述磁场优选由电流和/或电磁体产生。
54.简单来说，永磁体上下和前后移动，移动可以具有规则或重复的分量，但不是必须，并且其中空间方向不受特别限制。此外，除了平移运动之外，永磁体还可以绕一个或多个轴旋转运动。永磁体可以但不是必须撞击或重复撞击所述容器的壁。永磁体的运动优选非定向运动。此外，所述运动尽管可能不规则，但通常大约是位于所述容器内的平均位置-永磁体不离开容器。永磁体的运动通常具有一个或多个平移分量；并且所述平均位置可以是所述容器中间的某处。因此，这种运动不同于磁力搅拌器的运动(旋转运动)，磁体的平均位置位于或靠近盛有待混合或搅拌液体的容器底部。
55.术语“振荡”指规则的运动，而术语“波动”的含义更广，也包括不规则的运动。在这方面没有优选实施方式。
56.至少一个永磁体的运动优选由波动或振荡磁场触发。
57.磁场是控制磁体位置和/或运动的常用手段。假设根据本发明，永磁体发生移动，则在该优选实施方式中使用波动或振荡磁场。
58.优选地，所述磁场由电流产生。众所周知，电场和磁场是相互关联的；特别是电流会产生磁场。因此，控制电流是控制由此产生磁场的一种手段。
59.可选择地或另外地，但次优选地，所述磁场可以分别由外部永磁体产生或调制。术语“外部”意味着磁体不位于所述容器内。当使用外部磁体时，由此产生的磁场可以通过所述外部磁体相对于所述容器内的所述至少一个永磁体的相应运动而波动或振荡。
60.在一个优选实施方式中，所述磁场由电磁体产生。如在本文中使用的那样，术语“电磁体”在其最简单的实施方案中包括一个电导体，使用时电流流过该电导体。为了更好地控制磁场或者产生更强的磁场，本发明设想了电磁体的特定实施方案，将在下面进一步披露的优选实施方式展开。
61.在一个优选实施方式中，所述电流将波动或振荡。这种行为也可以称为一般“波”。电流的大小称为安培数。
62.在一个优选实施方式中，作为时间函数的所述电流的安培数是(i)矩形函数；(ii)
正弦函数；(iii)三角函数；(iv)锯齿函数；或(v)(i)至(iv)中任一项的组合或卷积。电流的时间曲线在本文也称“波形”。
63.考虑到电流振荡或波动，这也适用于模式(i)至(v)，即所述矩形和所述三角形函数实际上是重复的矩形和三角形函数。术语“模式”表示一系列事件中给定的基本事件至少重复一次。在更广泛的意义上，重复不必精确。例如，时间图中矩形的长度可以改变(这实际上相当于频率的改变，优选频率以及频率的优选时间相关性将在下文进一步说明)。
64.所有实施方式(i)至(v)在本文中也被称为“交流电”。
65.特别优选的是所述矩形函数(称为矩形波或方波)，更具体地是重复矩形函数的模式。发明人惊奇地发现，这种模式触发至少一个永磁体的特别剧烈运动，其中就混合而言，特别有效。
66.尽管如此，电流的其他时间曲线(波形)也得以成功完成；见实施例3。
67.在上述矩形函数中，高电流和低电流(或电流关断)的时间间隔可以相同，也可以不同。控制所述时间间隔长度的手段是技术人员已知的，例如脉宽调制(pwm)方法。值得注意的是，转移到反应混合物的能量不仅受制于电流的频率和振幅，还受制于所述时间间隔的相对持续时间。
68.磁场中每单位体积的能量定义为e
mag
＝1/2b2/μ0；b和μ0的定义见下文。e
mag
又等于或小于产生磁场电流的能量。后一种能量可以估计为e
curr
＝u i t，u是电压，i是产生磁场的电流安培数，t是电流流动的时间。换句话说，控制b、u、i和t中的任何一个都可以控制由永磁体传递到所述容器的内容物的能量。
69.尽管如此，还有其他手段来说明第一方面的方法的详细实施方案。这包括指定一个或多个可以更直接控制或测量的参数。这些参数包括电流的频率和安培数，就其使用的程度而言，还可以包括所述容器和线圈的尺寸。此外，磁场强度，优选永磁体场地的，可以定量说明实施细节。下文指定了所述参数的优选范围。
70.在一个优选实施方式中，所述电流以给定频率波动或振荡，该频率优选为0.1hz至20mhz，更优选为10hz至2khz、50至500hz、90至300hz或100至200hz。应当理解，这些措施不仅适用于正弦电流，而且适用于本文指定的所有电流分布，包括例如重复的矩形模式。术语“频率”也可适用于波动，即不规则的时间相关行为(规则的时间行为在本文中也称为“振荡”)，并且可以表征波动时间量程。在这种情况下，术语“频率”可理解为波动的平均频率。
71.事实证明，至少对于体积在一位数到两位数ml范围内的容器，以及标准96孔的板，80到300hz之间的较低频率表现得特别良好，而诸如大约1000hz的显著较高的频率在引起永磁体振动的同时，可能不会触发全范围运动，覆盖容器体积的显著大部分。这并不意味着更高的频率没有好处。此外，它们还可以与较低频率结合使用(见下文)。
72.更一般地说，优选的频率范围是确保永磁体不仅振动或旋转，而且执行平移运动的范围，该平移运动探索要用本发明的方法处理的材料的整个体积或基本上整个体积。所述体积通常是所述容器中的液相的总体积。
73.换句话说，虽然上面给出了关于体积在一位数到两位数ml范围内的容器和96孔板的指导，但是频率范围可能需要适应体积明显更小、体积明显更大或特殊几何形状的容器。举例来说，预期对于较小的体积，例如高密度微量滴定板(例如1536孔板)的孔，较高频率，例如大约1khz，诸如大于200hz的频率，导致永磁体产生运动，可与较大容器中在较低频率
下的运动相比。在任何情况下，接受了本说明书中的指导的技术人员能够以直接的方式探索和优化控制所述至少一个永磁体的运动的参数。如上面进一步解释的那样，优选永磁体执行平移运动，优选地除了旋转之外。
74.在一个优选实施方式中，当执行所述方法时，所述频率始终保持恒定。
75.在替换的优选实施方式中，所述频率随时间变化。
76.在另一优选实施方式中，在给定的时间点应用一个以上的频率。在这种情况下，多个频率中的每个频率可以从上面给出的优选范围中选择。一俟出现两个频率时，特别优选的是，第一频率在50hz和500hz之间，第二频率在80hz和20mhz之间。换句话说，这一优选实施方式为多个频率的叠加做准备。
77.一个以上的频率包括2、3、4、5、6、7、8、9和10个不同的频率。多个频率可以代替单个频率应用于整个过程，这意味着应用于该方法的整个执行过程中。此外，可以在较长时间跨度内的不同时间间隔中应用相同或不同的多个频率。在所述较长的时间跨度内，除了应用多于一个频率的多个时间间隔之外，仅应用一个频率时，可以有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个时间间隔。
78.在另一优选实施方式中，所述一个或多个频率是不是随时间恒定的，并且优选地以周期性的方式在两个或多个频率之间切换或逐渐改变。
79.典型方案是(120hz
–
1000hz)n、(200hz
–
1000hz)n或(100hz
–
800hz)n，其中n是整数，范围在2和1000之间，例如10和100之间，并且指定括号中频率模式要重复的次数。
80.具有恒定频率和/或恒定安培数的持续时间间隔没有特别限制。本文假设时间间隔范围在1秒和1天之间，如1分钟和1小时之间。
81.在另一优选实施方式中，所述电流(a)的安培数i在20ma和100a之间，优选在0.1和20a之间；(b)将所述磁体暴露于0.02和109a/m之间，优选10和106a/m之间的磁场强度；和/或(c)采用1秒至1周的时间间隔t，如10分钟至5小时。
82.磁场强度h决定了磁场场强，单位为a/米。h必须与磁通密度b相区别，这特别涉及使用磁芯来增强电流磁场的情况。
83.牢记，如上所述，作为时间函数的安培数在本文披露频率控制的时间量程上波动，在波动的时间量程上安培数不恒定。然而，出于实际目的，并且与电动力学既定实践一致的是，交流电可以通过其平均安培数来量化。在这种意义上，上述数值是平均安培数。值得注意的是，平均值优选在波动的时间量程上。这意味着，在使用间歇电流的情况下，当电流接通时，将会产生平均安培数，优选在上述范围内，而当电流断开时，安培数将归零。
84.在一个优选实施方式中，波动或振荡的幅度是(a)恒定的；或者(b)随时间变化，优选在比所述波动或振荡时间量程更慢的时间量程上变化。
85.该实施方式指的是所述电流的运动幅度。电流的振荡或波动幅度由安培数决定。
86.在另一优选实施方式中，所述电流是间歇的，和/或所述电流强度随时间变化，优选以周期性方式变化。这种随时间的变化通常在一个时间量程上，该时间量程慢于由交流电流频率定义的时间量程。换句话说，从本实施方式的意义上而言，如果交流电流随时间变化，则电流的时间依赖性是两种模式或波的叠加：交流电流固有的通常较快的波动，以及通常较慢的变化。
87.典型间歇模式是重复开启(1分钟)
–
关闭(1分钟)序列。上面已经给出其他优选的
时间间隔。间歇模式的优点是可以保持温度恒定或基本恒定，特别是在观察到容器所含之物正在加热的情况下。
88.在另一优选实施方式中，施加0至1000w之间，优选1至200w之间的功率。
89.在另一优选实施方式中，电流由电源供电。优选地，电源具有在大约0和240v之间的电势或电压u，如在0.1和75v之间。这些数值指施加的平均电压。
90.在另一优选实施方式中，所述电磁体包括至少一个线圈。优选地，所述线圈(a)具有多个绕组，如在1和104之间，优选地在10和1000之间；和/或(b)包括至少一个亥姆霍兹线圈；和/或(c)包含至少一个磁芯。
91.多个线圈的典型数量是2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、150、200、300、400和500。
92.术语“亥姆霍兹线圈”来自本领域现有技术，指的是通常两个相同线圈间隔布置，使得两者旋转对称轴对齐或重合。线圈之间空间中的磁场特别均匀和/或特别强。此外，可以使用多个亥姆霍兹线圈，如两个。
93.然而，使用亥姆霍兹线圈并不是成功实施本发明的必要条件；见实施例4。
94.已知进一步布置多个线圈提供了特别均匀磁场的扩展空间区域。另一个例子是麦克斯韦线圈。
95.磁芯用来加强磁场的作用。磁芯优选由铁磁材料制成，如铁，特别是软铁。磁通量密度b与磁场强度的关系如下：b＝μrμ0h。μ0是真空的磁导率，因此是基本的物理常数。另一方面，μr是相对磁导率，并决定了给定材料(例如在磁场影响下的铁磁芯)对磁通量密度的增强程度。典型地，用作磁芯的铁磁材料μr在103和106之间，如200000和400000之间的大约300000。合适的磁芯材料包括粉末金属、层压金属，以及退火铁、陶瓷和固体金属等退火金属。
96.在没有磁芯的情况下，b的优选值在10-8
和104tesla(t)之间，如在10-5
和1t之间。如果使用具有特定相对磁导率的磁芯，b的值要乘以所述相对磁导率。因此，在存在磁芯的情况下，b的优选值在10-2
和109之间，如1和106t之间。通常，这些数值指永磁体位置处或所述容器内的b。
97.就几何形状而言，线圈优选为圆形。优选的直径在1mm和1m之间，或1mm和0.5m之间，如2mm和300mm之间或2mm和200mm之间。还可以采用其他几何形状，例如具有正方形、矩形或三角形形状的线圈(即所有或部分绕组是正方形、矩形或三角形)。最后，请注意，线圈不是电磁体的必要要求，也可以使用两根反平行导线的布置(“反平行”指的是在给定时间点流经两根导线的电流方向)。
98.在另一优选实施方式中，使用多于一个的线圈，优选在2至104个之间，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个，或者10至1000个之间。应当理解，每个线圈可以具有一个或多个绕组，优选的绕组数量已在上文披露。
99.在一个优选实施方式中，所述磁性粒子在其表面上有至少一部分存在，其中所述部分选自(i)能够绑定靶分子的部分，所述部分优选为结合蛋白、亲和层析材料、吸收材料、吸附材料、探针或引物；(ii)能够将至少一种起始分子转化为至少一种产物分子的部分，所述部分优选为酶或化学催化剂；以及(iii)能够与靶分子形成加合物的部分；其中所述靶分子或起始分子分别存在于或觉得存在于所述液相中。
100.功能化和非功能化磁性粒子可从许多制造商处获得，例如，resyn biosciences(pty)ltd.，thermo fisher scientific，creative diagnostics，nanopartz inc.，alpha nanotech inc.，spherotech inc.和stratech。此外，技术人员可以使用已知程序制备功能化磁性粒子，参见例如sun等人，current pharmaceutical biotechnology，10 753-60(2009)和p
é
rez-ruiz等人，new biotechnology 33，755-762(2016)。
101.这些磁性粒子的制备可参见例如shang等人，langmuir，22，2516-2522(2006)，oberacker等人，bio-protocol 9(20):e3394和paulke br.，buske n.，winoto-morbach s.(1997)顺磁性聚苯乙烯胶乳粒子的合成研究。载于：u.,sch
ü
tt w.,teller j.,zborowski m.(编著)磁性载体的科学和临床应用。马萨诸塞州波士顿springer。
102.所述目标分子或所述起始分子通常会溶解或悬浮在所述液相中。
103.根据上述优选实施方式项目(i)的典型绑定部分是zro2。zro2与磷酸肽绑定。实施例2说明了根据本发明具有zro2部分磁性粒子的用途。
104.酶的实施例包括胰蛋白酶以及其它蛋白酶，如lysc、gluc、aspn、argc或胰凝乳蛋白酶，它们将蛋白质、多肽和较大的肽切割成片段。由于其大小特征，这些片段特别适合于质谱(ms)等下游分析方法。本文实施例1展示了在本发明实施方案和本领域磁性粒子处理方法的背景下使用胰蛋白酶包被的磁性粒子。
105.在另一优选实施方式中，第一方面的所述方法进一步包括或由以下步骤组成：(c)消除或使之静止，和/或使所述磁场不能触发所述运动；并且允许所述磁性粒子聚集在所述永磁体上；以及(d)清除所述液相。
106.本文中的词语“进一步由......组成”指的是那些通过由有限数量步骤所组成的方法得以完成的实施方案。在上述实施方式中，指的是根据第一方面定义的步骤(a)和(b)以及作为所述实施方式主题的步骤(c)和(d)。
107.磁场的清除可以通过物理地将外部磁体从容器移开来实现，移除程度要使得由外部磁体产生的磁场在容器内任何位置都可以忽略。可选择地或另外地，这适用于外部磁体是电磁体的实施方案，流经电磁体的电流可以显著减少或切断。
108.在又一个替代方案中，所述磁场没有移除，或者没有被清除到足以停止混合/分散过程的程度。在这种情况下，磁场以不再触发所述永磁体的所述波动或振荡运动的方式改变。如下面进一步披露的，为了触发这种运动，所述磁场本质上通常也在波动或振荡。通过将这种振荡或波动磁场改变为静态磁场，所述永磁体的运动将停止。这足以停止混合过程。一般来说，使所述磁场不能触发所述运动的改变都适于停止混合过程。
109.步骤(d)需要清除液相。值得注意的是，该阶段的所述液相可能与添加磁性粒子之前容器中的液相不完全相同。例如，如果所述液相在开始时包含与粒子表面部分绑定的化合物或分析物，则所述化合物或分析物将很少存在或不存在于要在步骤(d)中清除的液相中。
110.通常，收集阶段需要几秒钟，如0.1至600秒、1至60秒或10至30秒。
111.根据该优选实施方式，所述至少一个永磁体不仅是分散所述磁性粒子的装置，而且还用于在磁振荡或波动不存在或关闭时收集所述粒子。虽然许多现有技术方法也使用磁体来收集磁性粒子，但是所述磁体通常在所述容器的外部，并且还需要将所述磁体移动到容器附近或远离容器的设备。这种现有技术方法的另一个缺点是，容器至少在某种程度上
会屏蔽磁场，使得理论上可能的磁通密度在容器内部实际上无法实现。因此，大多数现有技术需要特别设计的具有非常高磁场强度的磁体。
112.本发明与这些方法的不同之处在于，所述至少一个永磁体位于容纳样品、反应混合物或待纯化混合物的容器内部。
113.上述chemagic方法将非永久的可磁化棒浸入混合物中，通过电磁在所述混合物中施加磁场。然而，本发明也与此不同：本发明使用的至少一个永磁体没有集成至机械移动磁棒的装置中，而是浸没在容器容纳的反应混合物中。由于这种差异，本发明中使用的永磁体为一次性元件。这样避免了由上述磁棒引入的交叉污染风险。
114.虽然第一方面的方法已经通过至少一个永磁体披露，但是值得注意的是，任何磁体都可以用于该目的。本文使用的术语“磁体”是指粒子的集合，其中至少一个粒子是磁体，并且所述粒子的集合由所述至少一个磁体的磁场介导。简而言之，在磁场中，所得到的集合本质上表现得像单个磁体，详情见下文。就尺寸而言，所述粒子将大于待破碎的分子(并且小于实施该方法的容器或反应器)。
115.在第二方面，本发明提供了一种从混合物中分离化合物的方法，所述方法包括或由以下步骤组成：(a)在容器中，使所述混合物与磁性粒子和至少一个永磁体接触，其中所述磁性粒子携带能够绑定所述化合物的部分；以及(b)利用磁场触发所述永磁体的波动或振荡运动；从而将所述化合物与所述混合物的剩余成分分离。
116.如上所述，所述永磁体的所述波动或振荡运动是一种混合手段，使所述绑定部分与所述化合物接触，发生绑定，这反过来为从液相成分剩余构成部分中分离提供了基础。
117.该方面利用了第一方面方法的优点，同时利用了特定类型的功能化粒子，即具有绑定部分的磁性粒子。如上所述，本文所用的“绑定”是指粒子上的部分和所讨论化合物之间的非共价相互作用。这种粒子通常设计用于分析或制备的分离过程。因此，第一方面的液相在此是混合物：除了目标化合物(在某些情况下也称为“分析物”)，这种混合物可以包含非目标或不预期的其他成分(如污染物)，并且第二方面的方法允许清除污染物等所述其他成分，并获得富集或纯的目标化合物。一般来说，第二方面的方法包括富集方法、消耗方法、纯化方法、隔离方法、分离方法、分馏方法和净化程序。
118.绑定部分的优选实施方式包括上面作为第一方面方法披露的优选实施方式。第一方面方法的这些优选实施方式定义了本发明所有方面的优选实施方式。进一步优选或典型部分将在下文和本文所附的实施例中进一步披露。
119.与许多现有技术方法的关键区别在于，控制磁性粒子运动和位置的磁体不在容器外部，而是存在于反应混合物中。因此，单个元件有两种功能：磁性粒子处理和反应混合物的彻底混合。
120.不同于现有技术方法的还有，磁体通常可以是一次性元件。由此容易避免磁体在样品之间的遗留。
121.虽然用于磁性分离的已知设备需要移动一个或多个磁体的机械元件，但在使用电磁体作为外部磁体的情况下，这是不必要的：控制流过电磁体的电流可以触发所述容器内永磁体的预期运动。
122.在一个优选实施方式中，所述方法进一步包括或由以下步骤组成：(c)清除、使静止和/或使所述磁场不能触发所述运动；并且允许所述磁性粒子聚集在所述永磁体上；以及
(d)从所述容器中除去所述混合物的剩余成分。
123.如上所述，这适用于与磁场清除相关的所有实施方式，清除磁场可以通过外部磁体和容器之间的物理运动和/或通过减少或切断流过电磁体的波动或振荡电流来实现。此外，磁场可能不会被清除，而是例如处于静止状态而无法触发容器内永磁体的运动。
124.剩余成分的清除以及从容器中清除其他液体(如下述清除用尽的清洗溶液，或者清除洗脱液)可以通过例如移液等现有手段和方法实现。
125.磁体上粒子的聚集通常发生在以秒为单位的时间量程上。加以必要的修正后，也适用于第一方面的相应优选实施方式。尽管如此，收集时间可能在某种程度上取决于所选择的设置，例如容器内永磁体的磁场强度和磁性粒子的尺寸。如下面进一步明显看到的，优选强磁性材料。此外，永磁体优选没有涂层，或者如有涂层，涂层不会对永磁体磁场产生强屏蔽效应。
126.在一个优选实施方式中，所述方法进一步包括或由以下步骤组成：(e)向所述容器中加入洗涤溶液；(f)使用所述磁场触发所述永磁体的波动或振荡运动；(g)消除所述磁场，使其静止，和/或使其不能触发所述运动；并且允许所述磁性粒子聚集在所述永磁体上；以及(h)从所述容器中清除所述洗涤溶液。其中步骤(e)至(h)可以重复。
127.该实施方式涉及适合于根据本发明进行磁性粒子处理的清洗程序。从而，该程序利用了容器内部的永磁体和外部磁体。这同样适用于下面的优选实施方式，该实施方式定义了最终在洗脱液中递送目标化合物的可选洗脱程序。
128.就进行重复洗涤而言，这可以用相同或不同的洗涤液来完成。技术人员可以根据所选择的具体应用进行适当选择。
129.在一个优选实施方式中，所述方法进一步包括或由以下步骤组成：(i)向所述容器中加入洗脱剂，所述洗脱剂可以减少或消除所述化合物与所述部分的绑定；(j)使用所述磁场触发所述永磁体的波动或振荡运动；以及(k)清除、使其静止和/或使所述磁场不能触发所述运动；以及允许所述磁性粒子聚集在所述永磁体上。
130.在一个优选实施方式中，所述方法进一步包括或由以下步骤组成：(l)从所述磁性粒子和所述永磁体中分离获得的洗脱液。
131.换句话说，典型的富集或净化过程将磁性粒子引入到包含目标分子或材料的样本中。与磁珠的接触带来绑定反应。将永磁体添加到样品/磁性粒子分散体中带来磁性分离，并将所述磁性粒子集合在磁体上。然后简单清除现在没有目标分子的剩余液体，并加入洗涤液。随后，引入波动或振荡磁场来分散和有效清洗磁性粒子。然后关闭电场，重新收集粒子，并去除在使用的洗涤液。最后，将洗脱缓冲液添加到磁性粒子中，并再次引入波动或振荡磁场进行有效的洗脱。在波动或振荡磁场再次关闭后，含有纯化目标分子的洗脱液可以进行进一步处理或分析。
132.在一个优选实施方式中，所述方法进一步包括或由以下一个或两个步骤组成：(a0)分解所述化合物；以及(a00)裂解存在的包含所述化合物的细胞；其中步骤(a00)(如执行)将在步骤(a0)和(a)之前实施；并且步骤(a0)(如执行)将在步骤(a)之前实施。
133.该优选实施方式通常涉及混合物或液相开始时更复杂的情况。“复杂性”可指所考虑的分析物，可以是例如生物来源的大的大分子，和/或分析物嵌入其中的可位于生物细胞或组织内部或表面的基质。
134.根据样品性质，步骤(a0)或步骤(a00)和(a0)可能会比较重要。
135.在特别优选实施方式中，步骤(a00)和/或步骤(a0)通过由所述外部磁体触发所述永磁体的波动或振荡运动来实现。
136.根据可能成为目标的下游分析，可能需要将大分子断裂以产生较小的化合物。这适用于大多数质谱样品测量。如申请人早期专利申请ep 20174469.5和ep 20174484.4中所述，移动磁体可以有效破碎蛋白质或核酸等生物大分子。这是上面披露步骤(a0)的主旨事项。经适当修正后，这同样适用于大分子不是目标分子，但希望其失活的情况。
137.类似地，如申请人早期专利申请wo 2020/002577和ep 20174484.4中所述，移动磁体也可以破碎生物细胞并由此使其内容物可得。这是上面披露步骤(a00)的主旨事项。
138.在第三方面，本发明提供了一种生产至少一种产物分子的方法，所述方法包括或由以下步骤组成：(a)在容器中，使至少一种起始分子与磁性粒子和至少一种永磁体接触，其中所述磁性粒子携带能够将所述至少一种起始分子转化为至少一种产物分子的部分；以及(b)利用磁场触发所述永磁体的波动或振荡运动；从而获得所述至少一种产物分子。
139.第三方面的方法利用了在其表面上携带催化剂的功能化磁性粒子。如上所述，这种催化剂可以是酶或化学催化剂。催化反应没有特别的限制。例子包括水解等裂解方法，和聚合等合成反应。
140.在一个优选实施方式中，所述至少一种产物分子并不一直与所述粒子绑定。换句话说，一旦催化反应完成，产物可以自由扩散离开磁性粒子。
141.在另一优选实施方式中，所述方法进一步包括或由以下步骤组成：(c)消除、使其静止和/或使所述磁场不能触发所述运动；并且允许所述磁性粒子聚集在所述永磁体上；以及(d)从所述容器中清除所述至少一种产物分子。
142.在第四方面，本发明提供了一种衍生第一化合物的方法，所述方法包括或由以下步骤组成：(a)在容器中，使所述第一化合物与磁性粒子和至少一个永磁体接触，其中所述磁性粒子携带能够与所述第一化合物形成加合物的部分；以及(b)利用磁场触发所述永磁体的波动或振荡运动；从而获得所述加合物。
143.第四方面的方法利用了在表面上携带化学反应基团的磁性粒子，其中与所述第一化合物和所述反应基团发生的化学反应导致了连接两者共价键的形成。
144.反应性基团没有特别的限制，可以由技术人员立即根据预期应用来选择。例如，如果第一化合物含有原氨基，适合的部分是nhs酯。
145.所述加合物也可以称为共轭物。该加合物包含或由所述化合物和所述部分组成，两者通过至少一个共价键连接。
146.优选地，所述加合物一直与所述粒子绑定。
147.应当理解，这种加合物的形成也是产生功能化磁性粒子的一种手段。换句话说，第四方面的方法可以用作生产功能化磁性粒子。
148.此外，通过该途径获得的功能化磁性粒子可以在本发明任一方面用作磁性粒子。
149.优选地，所述方法进一步包括或由以下步骤组成：(c)清除、使其静止和/或使所述磁场无法触发所述运动；并且允许所述磁性粒子聚集在所述永磁体上；以及(d)从所述容器中除去未绑定至所述粒子上的物质。
150.在一个优选实施方式中，所述方法进一步包括或由以下步骤组成：(e)向所述容器
中加入洗涤溶液；(f)使用所述磁场触发所述永磁体的波动或振荡运动；(g)消除所述磁场，使其静止，和/或使其不能触发所述运动；并且允许所述磁性粒子聚集在所述永磁体上；以及(h)从所述容器中清除所述洗涤溶液。其中步骤(e)至(h)可以重复。
151.如本技术中常见的，分析或制备过程中的洗涤步骤可以但非必须重复2、3、4、5、6、7、8、9或10次。这适用于本发明的所有方面。
152.与第四方面相关，本发明在第五方面提供了一种固相合成方法，所述方法包括一次或重复进行第四方面方法或其任何优选实施方式，其中所述磁性粒子构成固相。
153.重复次数没有限制。这取决于所选择的应用、所需的产品特性(如长度)，以及合成过程中常见的每次重复产量和最终产品的所需产量。
154.在第五方面方法的一个优选实施方式中，在第二次和进一步实施第四方面的所述方法期间，分别将第二种和另外的化合物添加到所述容器中，由此获得包含所述第一种、第二种和另外的化合物作为构建块的产品。
155.该优选实施方式可以实施为渐进的链延伸反应。第一回合中，在磁性粒子上的上述反应性部分和第一化合物之间形成加合物，第二回合中，在所述加合物和第二化合物之间形成缀合物。
156.例如，可以通过使用第一化合物来实现，该第一化合物除了具有与磁性粒子部分反应的基团之外，还具有另一个基团。该另一个基团本身或者在适当活化时能够与所述第二化合物形成共价键。经适当修正后，也适用于其他回合，直到在实施第五方面的方法时被执行。
157.所得产物虽然可以但不必具有一般类第一化合物-第二化合物-第三化合物等的顺序结构。根据磁性粒子上的化合物和/或部分，也可以获得分支或交联的产物。
158.为了避免不必要的副反应，可以使用合适的保护基团。当被保护基团发生反应时，就可以清除保护基团。保护和去保护的重复循环是本领域既有技术方法，例如用于固相肽合成的目的，并利用对fmoc和boc等基团的保护。
159.在一个优选实施方式中，所述加合物或所述化合物可分别从所述磁性粒子上裂解下来，例如通过酸性、碱性或光诱导的共价键裂解。
160.这是固相合成中的常用措施：一旦获得所需产物，仍然绑定至固相，即磁性粒子上。为了进一步处理或加工该产物，可将其从固相分离。
161.本发明方法用于合成目的的使用不限于上述固相合成方法，其中第一结构单元共价绑定至粒子上(至少直到最终产物裂解的时间点)。事实上，可以通过采用非共价相互作用来进行多轮重复的合成。其实施例包括至少两种核酸物种之间的杂交，例如在聚合酶链式反应(pcr)过程中可见。
162.应当理解，在涉及多个后续反应的此类方法过程中，除了上面明确列举的步骤之外，其他步骤可能是有益或必要的。这些其他步骤可以由技术人员立即应用，并且取决于具体的合成或要进行的其他方法。这种额外步骤的实施例包括在最终形成合成分子构建块的化合物之外加入其它试剂。这种试剂包括活化剂、封闭剂、中和剂或ph改变剂等。典型封闭剂见如上所述的fmoc和boc。
163.在以上披露任一方面方法的优选实施方式中，至少一个铁磁粒子或铁磁珠与所述至少一个永磁体一起添加。这是本发明所有方面方法的优选实施方式。出人意料的是，发明
人发现，添加铁磁粒子或铁磁珠，优选尺寸与永磁体尺寸相当或相同，通过使永磁体和所述珠粒的运动更加有力来改善混合。在这种设置中，可以使用多个永磁体和/或多个铁磁珠，但优选恰好一个永磁体和一个铁磁珠。
164.在所有方面方法的优选实施方式中，步骤(d)、(e)、(h)、(i)和(l)中的一个、多个或全部步骤可通过移液来实现。
165.一般来说，尤其是在这种移液的情况下，可以使用另一个磁体。为了作进一步解释，在磁场不触发容器内部永磁体的波动或振荡运动并且允许磁性粒子聚集在所述永磁体表面上的阶段期间，它们通常会由于重力而停留在容器底部。这又会导致移液效率降低或更加麻烦。因此，所述另一个磁体，例如另一个永磁体，可以被带至所述容器的外壁附近。这可以提供容器内部的永磁体以及位于所述壁(容器内部)的磁性粒子。在这一点移液时，可将移液管吸头插入容器中，并降至其底部。
166.在所有方面方法的优选实施方式中，所述磁场由外部磁体产生，其中所述外部磁体优选是(1)电磁体，其中波动或振荡电流流过所述电磁体；和/或(2)另一个永磁体或电磁体，其中所述容器和所述另一个永磁体或电磁体以波动或振荡的方式彼此相对移动。
167.特别优选选项(1)。
168.在以上披露任一方面方法的优选实施方式中，所述磁性粒子是顺磁性、亚铁磁性或铁磁性的。优选材料是磁铁矿。磁性粒子不必是永久磁性的。然而，适用于至少一个永磁体的材料也是适用于所述磁性粒子的磁性材料。
169.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述分析物或化合物可以是核酸、核糖核酸、糖、糖类、蛋白质、多肽、肽和/或脂质。
170.在前述任一方面方法的优选实施方式中，不同步骤在不同温度下进行。这种方案可用于聚合酶链式反应(pcr)，即使用最适温度高于环境温度的酶的酶促过程，或者升高温度作为干扰绑定(如降低绑定)的手段。
171.根据前述权利要求中任一项所述的方法，可同时处理多个容器，如微量滴定板的容器。
172.与所有前述方面相关，本发明还涉及使用至少一个永磁体、磁性粒子和磁场来混合容器中的反应混合物，其中所述至少一个永磁体和所述粒子在所述容器中，并且优选所述磁场由所述容器外部的另一个磁体产生。
173.如关于本发明方法所描述，所述另一个磁体可以实现为永磁体或诸如线圈的电磁体。
174.在另一方面，本发明提供了适于实施本发明方法和用途的元件作为试剂盒。这种试剂盒包括或由以下物质组成：(i)磁性粒子；(ii)至少一个永磁铁；以(iii)至少一种液体试剂，如缓冲剂。
175.在一个优选实施方式中，所述磁性粒子被功能化，优选绑定部分和/或反应部分。
176.一般来说，本发明方法的优选实施方式也定义了本发明的用途、试剂盒和设备的优选实施方式。例如，在优选实施方式中，除了所述至少一个永磁体之外，所述试剂盒包括至少关于本发明方法更详细描述的一个铁磁珠或非磁珠。
177.在另一优选实施方式中，所述试剂盒进一步包括或由以下组成：(iv)一份手册，其包括用于实施第一至第五方面中任一方面方法的说明书。
178.在另一优选实施方式中，试剂盒进一步包括至少一个容器或至少一个容器阵列，所述容器或容器阵列优选如上文所定义。
179.在另一方面，本发明提供了一种设备，包括或由以下部分组成：(i)用于产生磁场的装置；以及(ii)控制单元，其被配置为随时间改变所述磁场，以便执行本发明任何方面的方法。
180.为了作进一步解释，并且考虑第一方面方法的步骤(b)和(c)，所述控制单元使得磁场在步骤(b)的持续时间内触发所述永磁体的波动或振荡运动，并且使得磁场在步骤(c)期间不能通过关闭磁场等方式触发这种运动。
181.所述用于产生磁场的装置优选是上文关于本发明方法进一步定义的那些装置，即电导体或永磁体。
182.电磁体可以是电导体，优选至少一个线圈，更优选亥姆霍兹线圈。所述线圈的开口配置成可以容纳容器。
183.当使用电磁体时，所述控制单元优选被配置成输送如关于本发明方法详细描述的任何优选电流时间曲线。
184.在一个优选实施方式中，所述设备包括或进一步由容器组成。所述容器优选如上所述，例如可以是单个容器或容器阵列。
185.在另一优选实施方式中，所述设备进一步包括或由至少一个永磁体和/或磁性粒子组成，其中，对于设备包括的所述容器，所述永磁体和/或所述粒子优选位于所述容器内部。
186.永磁体和磁性粒子的进一步定义见上文。
187.一般来说，一个方面的优选实施方式在加以必要修正后定义了另一个方面的优选实施方式。
188.应当理解，所述设备被配置成使得所述粒子和所述磁体在所述容器内部并暴露于磁场，所述磁场优选由所述容器外部的所述电磁体或所述另一永磁体产生。
189.术语“容纳”是指所述线圈具有足够宽的开口，使得所述容器装配在所述开口内，结果是所述容器的内容物位于使用时所述线圈产生磁场特别强和/或特别均匀的地方。优选地，在所述容器具有圆形横截面的情况下(如圆柱形容器)，所述线圈的内径(在该情况下为圆形线圈)仅比所述容器的外径稍宽。“稍宽”可指0.01％到10％之间，如0.1％到1％之间。
190.一俟出现容器阵列(如微量滴定板)，线圈可以比所述阵列略宽。如果所述阵列呈矩形，则可以采用具有矩形形状的亥姆霍兹线圈。
191.控制单元还可以包括连接至电插头的电源或适配器。
192.该设备可以与包含实施本发明方法的说明书手册一起提供。
附图说明
193.这些图显示：
194.图1：“新型系统处理”显示了在前面样品制备过程中处理磁性粒子时，根据本发明通过ms进行的肽鉴定。相比之下，经典处理显示了使用现有磁性分离器时不同的已识别肽数量。
具体实施方式
195.这些实施例对本发明作了说明。
196.实施例1
197.与现有技术磁性分离器的性能比较
198.材料
199.具有大约100μg蛋白质含量的酿酒酵母细胞沉淀用于消化试验。永久钕磁铁用于磁珠处理(magnetexpert，球形，2mm)。裂解和净化使用包含缓冲液和塑料器皿的ist-kit(preomics gmbh，p.o.00001)。胰蛋白酶磁性粒子由resyn biosciences(resyn biosciences(pty)ltd)提供。亥姆霍兹线圈装置用于产生外部振荡磁场。
200.方法
201.经典磁性粒子处理
202.如标准ist样品制备(preomics gmbh，ist-kit，p.o.00001)中所述制备酿酒酵母细胞裂解物。用2x 70％乙醇平衡750μg固定的胰蛋白酶珠(胰蛋白酶磁性粒子)；1x 1％氢氧化铵3x 50mm tris，ph 8。对于每个平衡步骤，磁珠在500rpm下温育3分钟，使用磁性分离器清除上清液，并等待30秒后，收集磁性粒子。将平衡的磁珠与变性酵母样品混合。在37℃和500rpm下消化1小时。在肽纯化和lc-ms分析(参见标准ist样品制备)之前，使用磁性分离器从样品中取出磁性胰蛋白酶珠，并加入100μl终止缓冲液。洗脱后，纯化的肽在speedvac中干燥，并重新悬浮在2％乙腈、0.1％三氟乙酸中。在thermo ltq orbitrap xl和thermo fisher scientific easy n-lc 1200系统上分析样品。在自制的c18柱上使用45分钟梯度分离5μg的肽负载，并使用dda top 10方法进行串联质谱分析。除了非特异性搜索之外，使用maxquant软件和默认设置对照酵母数据库搜索ms/ms数据。
203.新型系统磁性粒子处理
204.如标准ist样品制备(preomics gmbh，ist-kit，p.o.00001)中所述制备酿酒酵母细胞裂解物。在具有2mm圆形钕磁体的helmholtz线圈装置上，用2x 70％乙醇、1x 1％氢氧化铵和3x 50mm tris(ph 8)平衡750μg固定化胰蛋白酶珠(胰蛋白酶磁性粒子)。对于每个平衡步骤，将样品在helmholtz系统上培养3分钟，施加120hz的方波函数，关闭磁场并让磁性粒子收集10秒后，清除上清液。将平衡的磁珠与变性酵母样品混合，并在helmholtz系统上应用120hz的方波函数消化60分钟。在肽纯化和lc-ms分析(参见标准ist样品制备)之前，从样品中取出磁体和磁性胰蛋白酶珠，并加入100μl终止缓冲液。洗脱后，纯化的肽在speedvac中干燥，并重新悬浮在2％乙腈、0.1％三氟乙酸中。在thermo ltq orbitrap xl和thermo fisher scientific easy n-lc 1200系统上分析样品。在自制的c18柱上使用45分钟梯度分离5μg的肽负载，并使用dda top 10方法进行串联质谱分析。除了非特异性搜索之外，使用maxquant软件和默认设置对照酵母数据库搜索ms/ms数据。
205.结果
206.参见图1及其说明文字。
207.讨论
208.就可通过ms鉴定的肽数量而言，本发明的方法表现得至少和磁性粒子的经典处理一样好。但如上所述，本发明的方法具有明显的优点，如不需要磁体在容器外机械运动，并且避免了交叉污染。
209.实施例2
210.材料
211.对于含有约100μg酵母蛋白的细胞沉淀，将可商购的酿酒酵母重新悬浮在h2o中，制备600nm下od为0.6的1ml等分试样并离心。lc-ms分析的标准样品制备使用preomics gmbh(p.o.00001)的ist试剂盒进行，包括缓冲液、酶和塑料器皿。永久钕磁铁用于磁珠处理(magnetexpert，球形，2mm)。zro2磁性粒子由resyn biosciences(resyn biosciences(pty)ltd)提供。亥姆霍兹线圈装置用于产生外部振荡磁场。使用阳离子交换柱进行肽的纯化。
212.方法
213.根据普雷奥米克斯标准方案(普雷奥米克斯有限责任公司，p.o.00001)对酵母样品进行样品制备，然后在磁性粒子(resyn biosciences)上富集磷酸肽，并使用反相柱纯化样品。纯化的肽在室温下完全真空干燥。
214.为了富集磷酸肽，需首先平衡磁珠。将半径为2mm的球形钕磁体加入至10μl的磁珠悬浮液中。澄清悬浮液后，取出上清液。加入50μl洗涤缓冲液(70％乙醇)，通过使用外部磁振荡场(120hz，方波，5分钟)混合样品。之后，澄清悬浮液，并取出上清液。重复该程序一次，用该缓冲液总共洗涤两次。
215.加入50μl 1％的氢氧化铵，用本发明的方法(120hz，方波，10分钟)再次混合样品。再次澄清样品，并取出上清液。然后使用上述相同程序，用50μl溶于5％三氟乙酸和80％乙腈中的0.2m乙醇酸平衡磁珠三次。
216.然后将100μl溶于5％三氟乙酸和80％乙腈中的0.2m乙醇酸加入至上述干燥肽沉淀中，并适当重新悬浮。再将溶液加入至平衡的磁珠中，并用本发明方法混合的同时进行温育(120hz，方波，20分钟)。澄清样品后，取出上清液。通过添加另外50μl溶于5％三氟乙酸和80％乙腈中的0.2m乙醇酸，并用本发明方法混合(120hz，方波，2分钟)清除尚未绑定的样品。澄清样品后，取出上清液。
217.加入100ul洗涤缓冲液(80％乙腈和1％三氟乙酸)，用本发明的方法混合样品(120hz，方波，2分钟)，然后澄清样品并取出上清液。用另一种洗涤缓冲液(10％乙腈和0.2％三氟乙酸)重复该步骤。
218.加入40μl洗脱缓冲液(1％氢氧化铵)，将磷酸肽从磁珠上洗脱下来，并使用本发明的方法(120hz，方波，5分钟)混合温育。澄清样品，取出上清液，并转移至新试管中。重复洗脱两次，总洗脱体积为120μl。
219.以最大速度离心含有洗脱液的试管，沉淀磁珠片段。使用磁性分离器，将上清液取出并转移至新的试管中。样品在室温下真空干燥，直到完全干燥。
220.接下来，加入200μl甲醇，在废液管中离心(3.800rcf，1分钟)，平衡阳离子交换柱。如上所述，使用200μl 2％乙腈、0.1％三氟乙酸缓冲液进行第二次平衡。
221.将干燥的磷酸肽重新悬浮在200μl 2％乙腈、0.1％三氟乙酸的缓冲液中，并装载到柱上进行离心(3.800rcf，1分钟)。然后加入200μl 0.1％甲酸，接着进行离心(3.800rcf，1分钟)，洗涤绑定的肽。该洗涤步骤重复两次。将柱转移至新的收集管中，加入溶于80％乙腈的200μl 0.1％甲酸的溶液，然后离心(3.800rcf，1分钟)，从柱中洗脱肽。洗脱步骤重复一次，使得洗脱步骤总共达到两次。样品在室温下真空干燥，直到完全干燥，然后重新悬浮
在6μl 2％乙腈、0.1％三氟乙酸的缓冲液中。
222.在thermo ltq orbitrap xl和thermo fisher scientific easy n-lc 1200系统上分析样品。在自制的c18柱上应用45分钟梯度分离肽，并使用dda top 10方法进行串联质谱分析。使用maxquant软件和默认设置对照酵母数据库搜索ms/ms数据。
223.结果
224.鉴定的蛋白质鉴定的肽磷酸肽(sty)[％]27741960.632
[0225]
讨论
[0226]
结果中明显的特异性表明，本发明的方法可以用于分离和富集目的，效果令人满意。
[0227]
实施例3：使用不同波形分散磁性粒子
[0228]
材料
[0229]
使用具有聚乙烯涂层的永久钕磁铁(圆柱形；2mm
×
2mm)。对于磁性粒子，使用3.0μm胺官能化磁珠。亥姆霍兹线圈用于产生外部振荡磁场。为了在规定频率下产生不同的波形，使用了在线音调发生器(https://onlinetonegenerator.com/)。
[0230]
方法
[0231]
充分混合1分钟，重新悬浮磁性粒子。将每50μl粒子的三个等分试样转移至0.5ml螺旋盖试管中。将材料用50μl超纯水(lc-ms级；fisher scientific)。每管增加一个磁铁。将试管转移至亥姆霍兹线圈，重复30秒。在1-140hz下应用方波函数、正弦函数、锯齿函数或三角函数。关闭磁场后，让磁性粒子在磁铁上停留30秒。
[0232]
结果
[0233]
对于所有施加的波形，当磁场打开时，磁性粒子在容器中混合。当磁场关闭时，磁珠沉淀在容器中的磁铁上。
[0234]
可观测到的混合效果差异(见表1)。
[0235]
表1：不同波形下不同频率的混合效果
[0236][0237]
讨论
[0238]
实验证明，分散磁性粒子可以通过不同频率、不同波形来完成。
[0239]
实施例4：用不同线圈分散磁性粒子
[0240]
材料
[0241]
使用具有聚对二甲苯涂层的永久钕磁铁(圆柱形；2mm
×
2mm)。对于磁性粒子，使用3.0μm胺官能化的磁珠。简单的线圈(与亥姆霍兹线圈相反)设置(8个小线圈排成一行；一圈直径1.1cm；高度2.0cm)用于产生外部振荡磁场。为在规定频率下产生不同的波形，结合使用了在线音调发生器(https://onlinetonegenerator.com/)与放大器(smsl sa-502x50w)。
[0242]
方法
[0243]
充分混合1分钟，重新悬浮磁性粒子。将每50μl粒子的三等分试样转移至1.5ml eppendorf反应容器中。将材料用50μl超纯水(lc-ms级；fisher scientific)。每管增加一个磁铁。
[0244]
将反应容器放置在线圈设置中(每个线圈一个容器)。样品重复温育30秒。在1-180hz下应用方波函数、正弦函数、锯齿函数或三角函数。关闭磁场后，让磁性粒子在磁铁上停留10-30秒。
[0245]
结果
[0246]
当磁场打开时，磁性粒子在单线圈设置中的容器中混合。当磁场关闭时，磁珠沉淀在容器中的磁铁上。
[0247]
不同频率下混合效果的可观测差异(见表2)。
[0248]
表2：不同波形、不同频率下的混合效果
[0249][0250]
讨论
[0251]
实验表明，可以不需要亥姆霍兹线圈，而用简单的线圈设置在不同频率范围和波形下分散磁性粒子。