一种测定海洋微生物附着的方法与流程

1.本发明涉及海洋环境监测技术领域，特别涉及一种测定海洋微生物附着的方法。


背景技术：

2.几乎所有与海洋接触的设备、装置、材料等，都面临长期服役困难的问题，海洋腐蚀和生物污损是其中的重要原因。海洋生物污损可以被定义为微生物、植物和动物在浸泡在海水中的人造表面上的聚集，并且对于经济、环境或安全等方面的负面影响。微生物膜是海洋生物污损形成的早期阶段，对于附着表界面的性质改变以及后续大型微生物的贴附都有着重要作用。在这个阶段中，附着的微生物分泌胞外基质后，与表界面形成化学作用以及微生物间的相互作用，使得微生物的可逆吸附转变为不可逆吸附，微生物便能稳定增殖和发育。微生物的附着为后续大型生物的附着以及生物污损的形成提供了重要基础。因此，监测微生物附着不但有利于认识生物污损的形成机制，更为生物污损的防治提供了重要保障。
3.电细胞基底阻抗传感技术(ecis)是一种实时、无标记的检测组织培养细胞活性的方法。ecis通常是基于平面微电极阵列实现，电极提供一个与溶液或细胞接触的界面，用于在较长时间内监测培养细胞群体的阻抗特性。其监测原理是，在工作电极和对电极间使用近似恒流源以不同频率施加小的交流电信号并实时记录流经传感器电压与电流的比值，即阻抗值。当细胞附着并散布在传感电极表面时，它们的身体有效地阻塞了可供离子电流流动的区域，并扰乱了电极/电解质界面，这通常会导致测量阻抗的大幅增加。通过对细胞与电极作用过程中的阻抗幅值的波动，可以动态反应出细胞的附着和扩散、增殖等生理活动。叉指电极是电细胞基底阻抗传感技术的传感元件，叉指电极通常采用光刻、刻蚀以及结合其他金属沉积工艺制备，需要一系列专用且昂贵的设备，操作繁琐且制备周期较长，成本较高，且受限于工艺条件，制备的电极在硅片等硬质基底上缺乏柔性，应用环境受到限制。因此目前ecis技术存在一定局限，一方面目前的研究对象集中在人体细胞或者动物细胞，对海洋微生物的测量鲜有报道，另一方面测量环境局限于细胞培养环境或体液环境，鲜有证据表明能在海洋高盐离子强度的环境下有效测量。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种测定海洋微生物附着的方法，能够在海洋高盐离子强度的环境下实现对海洋微生物附着情况的实时、无损、定量测定。
5.具体地，本发明采用如下的技术方案：
6.一种测定海洋微生物附着的方法，包括步骤：将海洋微生物传感器置于海水中，通过测试海洋微生物传感器的电化学特征来测定海洋微生物的附着情况；所述海洋微生物传感器包括叉指电极，所述叉指电极的指间隙为100～400μm。
7.相对于现有技术，本发明将具有一定指间隙的叉指电极制成海洋微生物传感器，
当海洋微生物附着于叉指电极区域时，由于微生物细胞膜的绝缘响应带来的电化学特征变化，传感器通过识别电化学特征的变化，进而识别出附着的微生物的量的变化，实现对海洋微生物附着情况的实时、无损、定量测定。而且，该方法适用于在海水高盐离子强度的环境下海洋微生物附着的测定，而不局限于细胞培养环境或体液环境。
8.在本发明的一些实例中，所述叉指电极的指间隙优选100～350μm，更优选200～300μm，进一步优选200μm。叉指电极的形状对检测的灵敏度具有重要影响，叉指电极的指间隙需足够小，才能对微生物附着检测具有高灵敏度。
9.在本发明的一些实例中，所述叉指电极的指宽为10～30μm，优选15～25μm，更优选20μm。
10.在本发明的一些实例中，所述叉指电极中的导电成分为银或金，优选银。相比于贵金属金，银具有更低的单价，有效降低成本，适合扩大生产。
11.在本发明的一些实例中，所述叉指电极的制备方法包括如下步骤：使用导电墨水在基底上喷墨打印，形成叉指电极图案，退火得到所述叉指电极。喷墨打印是一种用于液相材料的沉积技术，该技术的过程是通过压电陶瓷的周期性运动，从喷嘴中挤出一定量的印刷墨水。喷射的墨滴由于重力垂直下落，在接触基底后由于表界面的亲疏水性差异产生不同程度的扩散，然后液滴通过溶剂蒸发和烧结过程，最终在基底上形成所需要的图案。喷墨打印由于其技术特征对于基底有广泛的适应性，因此特别适用于在各种基底，例如柔性基底上制备叉指电极。且相比于传统的光刻工艺，喷墨打印的制备流程简单，器件成型周期短，同时具有不低的加工精度。
12.在本发明的一些实例中，所述导电墨水包括导电银墨水、导电金墨水中的至少一种，优选导电银墨水。
13.在本发明的一些实例中，所述导电墨水中，银含量(或金含量)7wt％～13wt％，粘度7～8mpa
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s，表面张力26～28dyne/cm，体积电阻率3～10μω
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cm。
14.在本发明的一些实例中，所述喷墨打印的设置参数为：喷墨打印头点间距(两墨滴间的距离)10～20μm，喷墨打印头喷口电压20～26v，打印平台移动速度200～300mm/s，电极打印层数4～6层，打印期间平台预加热温度为50～90℃。在制备过程中，需要调整打印精度，确保叉指间不会相互交联，导通，避免传感器失效。
15.在本发明的一些实例中，所述退火的温度为140～160℃，时间为20～40min。
16.在本发明的一些实例中，所述基底包括聚酯(pet)、聚乙烯醇(pva)、聚酰亚胺(pi)、聚萘二甲酯乙二醇酯(pen)、聚二甲基硅氧烷(pdms)中的只少一种。此类基底均为柔性基底，相较于传统硬质硅基底，使得叉指电极能承受更大程度的形变，因此海洋微生物传感器具备良好的柔性和环境适应性。所述基底的厚度可根据实际需要进行合理选择，例如厚0.05～0.5mm。
17.在本发明的一些实例中，所述在喷墨打印前，还包括对基底进行表面改性的步骤。通过表面改性来改变基底表面亲疏水状况，增加其与喷墨打印所用导电墨水的适配性。
18.在本发明的一些实例中，所述表面改性的方法包括真空等离子清洗。清洗参数为：50～80kw，20～50s；优选60～70kw，30～40s。
19.在本发明的一些实例中，所述海洋微生物传感器的组装方法为：将导线对所述叉指电极的接线区连接，然后对叉指电极与导线连接处以及叉指区域以外的部分进行封装，
得到海洋微生物传感器。传感器在封装时需确保密封性，否则会导致传感器失效。
20.在本发明的一些实例中，所述电化学特征包括阻抗、电压、电流、电容中的至少一种，优选阻抗。当海洋微生物附着于叉指区域时，微生物细胞膜的绝缘响应会带来电阻抗的增加。
21.在本发明的一些实例中，所述阻抗通过扫频测量的方法进行测试，扫描频率为4hz～8mhz。
22.在本发明的一些实例中，所述扫频测量采用恒电压模式。
23.在本发明的一些实例中，所述海水的盐含量≥2％，优选≥3％，更优选3％～5％。
24.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
25.1.本发明将叉指电极制成海洋微生物传感器，适用于在海水高盐离子强度的环境下海洋微生物附着的测定，而不局限于细胞培养环境或体液环境。当海洋微生物附着于叉指电极区域时，由于微生物细胞膜的绝缘响应带来的电化学特征变化，传感器通过识别电化学特征的变化，进而识别出附着的微生物的量的变化，实现对海洋微生物附着情况的实时、无损、定量测定。
26.2.本发明可基于喷墨打印的原理制备传感器的核心部件叉指电极，相比于传统的光刻工艺，制备流程简单，器件成型周期短，同时具有不低的加工精度。
27.3.本发明的海洋微生物传感器可基于柔性基底制得，相较于传统硬质硅基底的叉指电极，能承受更大程度的形变，故本发明的海洋微生物传感器具备良好的柔性和环境适应性。
附图说明
28.图1为实施例1的传感器制备流程示意图；
29.图2为实施例1的传感器的光学照片；
30.图3为实施例1的传感器叉指区域的表面形貌图；
31.图4为实施例1小球藻附着前和附着24h后阻抗扫频图谱；
32.图5为实施例1小球藻附着24h后归一化阻抗扫频图谱；
33.图6为实施例1小球藻附着时阻抗随时间的变化关系；
34.图7为实施例1小球藻附着后不同时间的荧光显微镜观测结果；
35.图8为传感器测量海洋微生物附着示意图；
36.图9为实施例2监测小球藻附着24h后的相对阻抗；
37.图10为实施例2小球藻附着时阻抗随时间的变化关系；
38.图11为实施例2小球藻附着后不同时间的荧光显微镜观测结果；
39.图12为实施例3不同叉指间隙的传感器光学拍照；
40.图13为实施例3不同叉指间隙的传感器阻抗基线。
具体实施方式
41.以下结合具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。以下实施例中所用的原料，如无特殊说明，均可从常规商业途径得到；所采用的工艺，如无特殊说明，均采用本领域的常规工艺。
42.实施例1
43.本实施例采用由叉指电极组装的海洋微生物传感器测定海洋微生物的附着情况，首先制得海洋微生物传感器，然后利用人工海水模拟海洋环境，采用所制成的传感器测定海洋微生物的附着情况。具体步骤如下：
44.s1、基底的表面改性：取0.1mm厚的柔性pet基底，使用真空等离子清洗机对基底进行表面改性，清洗参数：时间35s，功率60kw。
45.s2、喷墨打印的参数调试：选取市售cp12导电银基墨水，银墨水参数：7％～13％，粘度7～8mpa
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s，表面张力26～28dyne/cm，体积电阻率3～10μω
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cm。调试该墨水在微电子打印机上的工艺参数，使能在基底上稳定打印出连续、窄线宽、导电性良好的图形。调试参数为：喷墨打印头点间距20μm，喷墨打印头喷口电压20v，打印平台移动速度200mm/s，电极打印层数4层，打印期间平台预加热温度为50℃。
46.s3、叉指电极的制备：设计指宽20μm，指间隙200μm的叉指电极图案，在步骤s1表面改性后的柔性pet基底上打印叉指电极，随后将叉指电极置于恒温加热平台进行加热退火后处理，退火处理参数为：150℃，30min。
47.s4、传感器的组装封装：用kapton高温胶带将导线(镀银无氧铜丝，线径为0.25mm，总线线径为0.45mm)与叉指电极接线区固定，用导电银胶增加导线与叉指电极连接处的接触面积和导电性。将pdms预聚物与固化剂按10:1的质量比例混合，再放入真空干燥箱1h去除气泡制成液态pdms，预留一部分，再将另一部分放在加热平台上150℃，10min处理为固态pdms。切割与叉指电极封装区大小匹配的固态pdms边框，再用液态pdms与叉指电极封装区连接、加热固定，加热时间：150℃，30min。至此海洋微生物传感器(以下简称传感器)制备完成。传感器的制备流程如图1所示，制备成的传感器光学拍照如图2所示，传感器叉指区的表面形貌如图3所示。
48.s5、人工海水配制与灭菌：根据配方配制人工海水并用高温灭菌锅灭菌。人工海水配方为：nacl 24.54g/l、kbr 0.10g/l、kcl 0.70g/l、na2so
4 4.09g/l、nahco
3 0.20g/l、cacl
2 1.16g/l、mgcl2·
6h2o 11.1g/l、srcl2·
6h2o 0.04g/l、h3bo
3 0.03g/l、naf 0.03g/l。高温灭菌参数为：120℃，15min。
49.s6、初始阻抗测定：将传感器置于模拟海洋环境的人工海水中，采用恒电压模式，电压为10mv，对传感器的阻抗值扫频测量，扫描频率为4hz～8mhz，将此时的阻抗记为阻抗基线z0。
50.s7、被测微生物接种：选取已培养至对数期的海洋小球藻为测量对象，以5000rpm/min，5min的参数对小球藻培养液离心，去除上清液，用上述人工海水复溶沉淀，即完成小球藻接种。
51.s8、微生物敏感频率确定：小球藻附着24h后扫频测量传感器阻抗，扫描频率为4hz～8mhz，计算被测的海洋微生物的相对阻抗zr。
[0052][0053]
式中z
24h
为小球藻附着24h后测量阻抗，z0为阻抗基线。选择变化最为显著的zr，所对应的频率即为被测微生物的敏感频率。图4显示了小球藻附着前后测量的阻抗，图5显示了小球藻附着前后相对阻抗变化曲线以及小球藻附着的敏感频率区间。从图4和图5可以看
出，微生物敏感频率区间为17khz～177khz。
[0054]
s9、微生物的附着监测：将传感器置于人工海水中，接种海洋小球藻溶液，固定测量频率为敏感频率，测定传感器阻抗值随时间t的变化。将传感器测量阻抗转化为细胞指数(cell index)(ci)，ci计算公式如下：
[0055][0056]
式中z
t
为小球藻附着任意时刻测测量阻抗，z0为未附着小球藻时的测量阻抗。未附着时，ci为零，小球藻附着数量越多，ci值越高，理论上可以通过细胞指数表达任意时刻电极上小球藻的附着情况。图6显示了小球藻附着24h内的阻抗变化。图6显示，随着时间增加，传感器检测到的阻抗逐渐增大，一段时间后阻抗增大的趋势减小，反映了该传感器可用于海洋环境中监测海洋生物附着情况。
[0057]
此外，为了佐证该方法测量的有效性，还选取显微拍照作为比对方法，不同时间小球藻附着情况的荧光显微镜拍照结果如图7所示。图7中黑色部分是叉指电极，绿色矩形和绿色斑点分别为pet基底和附着的小球藻，随着附着时间的增加，叉指上附着的微生物逐渐增多，与图6中阻抗随附着时间逐渐增大的测试结果对应，该测定过程的示意图如图8所示。
[0058]
实施例2
[0059]
本实施例与实施例1的不同之处在于：用于组装传感器的叉指电极为金叉指电极。该金叉指电极的指宽为100μm，指间隙为100μm。
[0060]
按照与实施例1相同的测试方法，采用该传感器进行海洋微生物附着测定，得到小球藻附着24h后的相对阻抗如图9所示，小球藻附着时阻抗变化如图10所示，不同时间荧光显微镜比对拍照如图11所示。测试结果显示，金叉指电极也可用于海洋环境中监测海洋生物附着情况，随着时间增加，传感器检测到的阻抗逐渐增大，一段时间后阻抗增大的趋势减小。
[0061]
实施例3
[0062]
本实施例与实施例1的不同之处在于，用于组装传感器的叉指电极为200μm、300μm、400μm、500μm叉指间隙的叉指间隙。不同叉指间隙的传感器光学拍照如图12所示，图中(a)～(d)对应的叉指间隙依次为200μm、300μm、400μm、500μm，不同叉指间隙的传感器阻抗基线如图13所示。测试结果显示。测试结果显示，小的叉指间隙有利于阻抗基线减小，进而有利于传感区域灵敏度提高。
[0063]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。