一种达肝素钠寡糖检测的新方法与流程

nm；上样量：200 μl；收集模式：按体积收集。
11.（3）样品浓缩：将步骤（2）中的样品真空离心浓缩。
12.（4）阴离子交换-高效液相色谱分离色谱条件如下。色谱柱：waters spherisorb s5 sax（4.0
×
250mm）；流速：0.45 ml/min；柱温：35 ℃；检测波长：234 nm；进样体积：20 μl；流动相a：磷酸二氢钠溶液；流动相b：磷酸二氢钠-高氯酸钠溶液；洗脱类型：梯度洗脱。
13.流动相梯度：本发明与现有分离方法相比，其优点在于：操作简单，分子排阻色谱法分离得到的寡糖纯度高；进一步采用阴离子交换-高效液相色谱分离后，可以分离相同链长的不同寡糖。同时本方法既可用于达肝素寡糖链的分析，也可以用于其他低分子肝素寡糖链的分析。
附图说明
14.图1为本发明实例中四糖分离色谱图图2为本发明实例中六糖分离色谱图图3为本发明实例中不同批次间样品四糖对比图图4为本发明实例中不同批次间样品六糖对比图。
具体实施方式
15.通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。
16.溶液配制达肝素钠溶液：称取达肝素钠25mg，加水1ml溶解，混匀。取适量，用肝素酶i酶解。
17.0.2 mol/l 碳酸氢铵溶液：称取碳酸氢铵15.8g，加水1000ml溶解，混匀，即得。
18.磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠40mg，加水1000ml溶解，用磷酸调节ph值至3.0，混匀，即得。
19.磷酸二氢钠-高氯酸钠溶液：称取磷酸二氢钠40mg、高氯酸钠140g，加水1000ml溶解，用磷酸调节ph值至3.0，混匀，即得。
20.从达肝素钠中收集混合四糖组分及混合六糖组分取达肝素钠溶液，用分子排阻色谱法分离：色谱柱为两根superdextm peptide 10/300 gl色谱柱串联，流动相为0.2 mol/l碳酸氢铵，流速为0.4 ml/min。收集混合四糖组分及混合六糖组分，真空离心浓缩至干。
21.四糖及六糖的分离
取浓缩后的混合四糖组分及混合六糖组分，加水溶解后，用阴离子交换-高效液相色谱法分离：色谱柱为waters spherisorb s5 sax（4.0
×
250mm），流速为0.45 ml/min，柱温为35 ℃，检测波长为234 nm。流动相a为磷酸二氢钠溶液，流动相b为磷酸二氢钠-高氯酸钠溶液。
22.流动相梯度：四糖及六糖分离色谱图分别见附图1、附图2。由附图可见，采用该方法，四糖及六糖出峰时间及峰形不同，四糖混合组分中各个组分能够达到有效分离，六糖混合组分中各个组分也能达到有效分离。
23.样品间对比将本发明的收集及检测方法用于不同批次间样品对比，四糖或六糖对比图见附图3及附图4。由附图可见，四糖色谱图中，两批样品在12.5分钟至25.0分钟色谱峰个数有差异；六糖色谱图中，12.5分钟至25.0分钟及37.5至50.0分钟色谱峰个数及峰形存在差异，尤其是37.5至50.0分钟，明显可见上面的色谱图中多2个色谱峰。该方法能够检测出不同批次样品的微小差异，尤其是六糖，不同批次样品色谱图中峰个数及峰形均有明显差异。
24.综上，经分子排阻色谱及阴离子交换-高效液相色谱联用法分离后，达肝素钠四糖及六糖中各个组分可以达到有效分离，分离度良好。检测不同批次样品时，样品间的差异非常明显，说明该方法可用于达肝素钠的精细结构解析。


技术特征：
1.一种达肝素钠寡糖检测的方法，其特征在于，该检测方法包含如下步骤：a、取达肝素钠，用水溶解后，用肝素酶i酶解；b、采用分子排阻色谱分离出混合四糖组分及混合六糖组分；c、将分离出的混合四糖组分及混合六糖组分采用真空离心浓缩；d、采用阴离子交换-高效液相色谱法分离浓缩后的混合四糖组分及混合六糖组分，以用于结构对比。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤c中，所述色谱条件如下：仪器：akta；色谱柱：两根superdextm peptide 10/300 gl色谱柱串联；流动相：0.2 mol/l 碳酸氢铵；洗脱类型：等度洗脱；流速：0.4 ml/min；检测波长：232 nm；上样量：200 μl；收集模式：按体积收集。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤d中，所述色谱条件如下：仪器：高效液相色谱仪；色谱柱：waters spherisorb s5 sax（4.0
×
250mm）；流速：0.45 ml/min；柱温：35 ℃；检测波长：234 nm；进样体积：20 μl；流动相a：磷酸二氢钠溶液；流动相b：磷酸二氢钠-高氯酸钠溶液；洗脱类型：梯度洗脱。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤d中，所述梯度洗脱过程如下：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）055452554554.5208064.52080655545855545。

技术总结
本发明公布了一种达肝素钠寡糖检测的新方法，属于多组分生化原料药分析技术领域。目的在于利用较少的操作步骤及较简单的流动相分离达肝素钠中的四糖及六糖，用于达肝素钠的精细结构对比。开发出的方法包括如下几个步骤：（1）供试品溶液的制备、（2）分子排阻色谱分离、（3）样品浓缩、（4）阴离子交换-高效液相色谱分离。本发明与现有分离方法相比，其优点在于：操作简单，分子排阻色谱法分离得到的寡糖纯度高；进一步采用阴离子交换-高效液相色谱分离后，可以分离相同链长的不同寡糖。同时本方法既可用于达肝素寡糖链的分析，也可以用于其他低分子肝素寡糖链的分析。低分子肝素寡糖链的分析。


技术研发人员：贾欣欣 贾风燕 王晓艳 彭喻嫄 于常霞 吴晓明
受保护的技术使用者：烟台东诚药业集团股份有限公司
技术研发日：2022.05.20
技术公布日：2022/9/8