一种真菌染色液及其制备方法与流程

1.本发明属于真菌检测技术领域，具体涉及一种真菌染色液及其制备方法。


背景技术：

2.真菌是一种具有真核的、产孢的、无叶绿体，以吸收为营养方式的异养生物，其包含霉菌、酵母、蕈菌以及其他菌菇类，目前已经发现了十二万余种真菌。真菌独立于动物、植物和其他真核生物，其细胞含有甲壳素，细胞壁的主要成分为几丁质或纤维素或两者兼有，且真菌可通过无性繁殖和有性繁殖的方式产生孢子，延续种群。
3.真菌营养生长阶段的结构称为营养体结构。绝大多数真菌的营养体都是可分枝的丝状体，单根丝状体称为菌丝，许多菌丝在一起统称为菌丝体，菌丝体在基质上生长的形态称为菌落。菌丝在显微镜下观察时呈管状，具有细胞壁和细胞质，无色或有色。菌丝可无限生长，但直径是有限的，一般为2-30微米，最大的可达100微米。低等真菌的菌丝没有隔膜，称为无隔菌丝，而高等真菌的菌丝有许多隔膜，称为有隔菌丝。此外，少数真菌的营养体不是丝状体，而是无细胞壁且形状可变的原质团或具细胞壁的、卵圆形的单细胞。寄生在植物上的真菌往往以菌丝体在寄主的细胞间或穿过细胞扩展蔓延。当菌丝体与寄主细胞壁或原生质接触后，营养物质因渗透压的关系进入菌丝体内。有些真菌如活体营养生物侵入寄主后，菌丝体在寄主细胞内形成吸收养分的特殊机构称为吸器。吸器的形状不一，因种类不同而异，如白粉菌吸器为掌状，霜霉菌为丝状，锈菌为指状，白锈菌为小球状。有些真菌的菌丝体生长到一定阶段，可形成疏松或紧密的组织体。菌丝组织体主要有菌核、子座和菌索等。菌核是由菌丝紧密交织而成的休眠体，内层是疏丝组织，外层是拟薄壁组织，表皮细胞壁厚、色深、较坚硬，菌核的功能主要是抵抗不良环境，但当条件适宜时，菌核能萌发产生新的营养菌丝或从上面形成新的繁殖体。菌核的形状和大小差异较大，通常似绿豆、鼠粪或不规则状。子座是由菌丝在寄主表面或表皮下交织形成的一种垫状结构，有时与寄主组织结合而成，子座的主要功能是形成产生孢子的机构，但也有度过不良环境的作用。菌索是由菌丝体平行组成的长条形绳索状结构，外形与植物的根有些相似，所以也称根状菌索，菌索可抵抗不良环境，也有助于菌体在基质上蔓延。
4.有些真菌像细菌和微生物一样都是分解者，可分解死亡生物的有机物为各类无机物，增强土地的肥力。有些真菌可作为重要的食物来源，其中可食用的蕈菌有200多种，如冬菇、草菇、木耳、云耳等；某些真菌可侵入生物空壳，如冬虫夏草；还有的真菌可用于食物加工，例如酵母菌用于面包等加工。还有部分真菌有害，可引起动、植物和人类的多种疾病，在人类主要有三种类型：(1)真菌感染；(2)变态反应性疾病；(3)中毒性疾病。有超过300种真菌对人类有致病性，对医学领域而言有意义的致病性真菌大多是霉菌。临床上以真菌攻击人体的不同位置为界限，将致病性真菌划分为浅部真菌与深部真菌。其中，浅部真菌的侵犯部位包括人体皮肤、毛发等。深部真菌的攻击范围不仅有人体皮肤和黏膜，还包括人体的深层组织甚至内脏，严重者会引发全身散播性感染，例如艾滋病所带来的并发散播性组织胞浆菌病。
5.采用直接镜检法鉴别真菌是一种真菌检测中常用的简便方法，例如，专利cn201910296267.2公开了一种真菌染色液和真菌染色方法，所述染色液分为a液和b液；a液为氢氧化钾水溶液，含有氢氧化钾的浓度为9-15wt％，还含有浓度为0.1-0.3wt％的龙胆二糖；b液为苯酚的亚甲蓝溶液，其中亚甲蓝的浓度为0.1wt％，苯酚的浓度为2-3vol％，还含有浓度为0.1-0.3wt％的l-赖氨酸盐酸盐。专利cn201710222262.6则公开了一种乳酸酚棉蓝染色液及其制备方法，所述的乳酸酚棉蓝染色液包括10-15份pva、20-40份乳酸、20-40份苯酚和0.05-0.1份苯胺蓝。
6.现有技术中虽然已经存在真菌染色的方法，但提供一种染色结果更准确、更高效的真菌染色液仍具有十分重要的意义。


技术实现要素：

7.针对上述不足，本发明提供了一种真菌染色液及其制备方法。所述的真菌染色液包括苯胺蓝、羧甲基纤维素钠、天冬氨酸、氯化十六烷基吡啶和苹果酸，采用本发明所述的染色液用于真菌染色，其效果好，准确度高，且操作简便，可用于真菌染色检测的大规模应用和推广。
8.为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
9.一方面，本发明提供了一种真菌染色液，所述的真菌染色液包括苯胺蓝、羧甲基纤维素钠、天冬氨酸、氯化十六烷基吡啶和苹果酸。
10.具体地，所述的真菌染色液包括苯胺蓝0.01-0.1份、羧甲基纤维素钠1-15份、天冬氨酸1-20份、氯化十六烷基吡啶0.01-1份和苹果酸10-30份。
11.进一步具体地，所述的真菌染色液包括苯胺蓝0.03-0.07份、羧甲基纤维素钠5-10份、天冬氨酸5-15份、氯化十六烷基吡啶0.05-0.5份和苹果酸15-25份。
12.进一步具体地，所述的真菌染色液包括苯胺蓝0.05份、羧甲基纤维素钠8份、天冬氨酸10份、氯化十六烷基吡啶0.1份和苹果酸20份。
13.进一步具体地，所述的羧甲基纤维素钠的分子量为600000-900000，优选为700000。
14.进一步具体地，所述的天冬氨酸与氯化十六烷基吡啶的质量比为1:0.05-0.5，优选为1:0.1。
15.另一方面，本发明提供了上述真菌染色液的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
16.将所述羧甲基纤维素钠、天冬氨酸、氯化十六烷基吡啶、苹果酸、苯胺蓝依次加入200-300份水中，加热至45-55℃，搅拌至溶解，冷却至室温，备用。
17.又一方面，本发明还提供了上述真菌染色液在真菌直接镜检法鉴别中的应用。
18.又一方面，本发明还提供了一种真菌染色的方法，所述的方法包括以下步骤：
19.取待测真菌样本，滴加上述真菌染色液1-2滴，混匀5-10s，显微镜下观察。
20.具体地，所述的样本包括但不限于玻片样本或涂片样本。
21.与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
22.(1)采用本发明所述的真菌染色液用于真菌染色，可在显微镜低倍镜、高倍镜及油镜下直接观察真菌菌丝及孢子结构，染色效果好，且检测准确度高。
23.(2)本发明所述的检测方法操作简便，染色时间短，适用于快速高效真菌检测，适用于大规模应用和推广。
附图说明
24.图1为低倍镜染色结果示意图。
25.图2为高倍镜染色结果示意图。
26.图3为油镜染色结果示意图。
具体实施方式
27.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
28.以下实施例1-3、对比例1中的羧甲基纤维素钠平均分子量为700000，购自sigma-aldrich，货号：419338。对比例2中的羧甲基纤维素钠平均分子量为250000，购自sigma-aldrich，货号：419281。
29.实施例1.一种真菌染色液
30.所述的真菌染色液包括：苯胺蓝0.05份、羧甲基纤维素钠8份、天冬氨酸10份、氯化十六烷基吡啶0.1份和苹果酸20份。
31.所述的真菌染色液的制备方法为：将上述真菌染色液各成分按照羧甲基纤维素钠、天冬氨酸、氯化十六烷基吡啶、苹果酸、苯胺蓝依次加入250份水中，加热至50℃左右，搅拌至溶解，冷却至室温，备用。
32.实施例2.一种真菌染色液
33.所述的真菌染色液包括：苯胺蓝0.07份、羧甲基纤维素钠10份、天冬氨酸15份、氯化十六烷基吡啶0.5份和苹果酸25份。
34.所述的真菌染色液的制备方法同实施例1。
35.实施例3.一种真菌染色液
36.所述的真菌染色液包括：苯胺蓝0.03份、羧甲基纤维素钠5份、天冬氨酸5份、氯化十六烷基吡啶0.05份和苹果酸15份。
37.所述的真菌染色液的制备方法同实施例1。
38.对比例1.一种真菌染色液
39.所述的真菌染色液包括：苯胺蓝0.2份、羧甲基纤维素钠20份、天冬氨酸25份、氯化十六烷基吡啶2份和苹果酸40份。
40.所述的真菌染色液的制备方法同实施例1。
41.对比例2.真菌染色液
42.所述的真菌染色液包括：苯胺蓝0.05份、羧甲基纤维素钠8份、赖氨酸10份、氯化十六烷基吡啶0.1份和乳酸20份。
43.所述的真菌染色液的制备方法同实施例1。
44.对比例3.真菌染色液
45.所述的真菌染色液包括：10份pva、20份乳酸、20份苯酚和0.05份苯胺蓝。
46.制备方法如下：
47.将10份pva粉末加入50m的去离子水的烧杯里，把烧杯放在加热的可以搅拌的板上，加入一个磁棒用来混匀；烧杯中放入一个温度计来监测温度；依次加入20份乳酸、20份苯酚结晶和0.05份苯胺蓝。加热并混匀溶液直至温度达70、75、80、85或90℃，从加热板上移除。将制备的乳酸酚棉蓝染色液分装到小的滴瓶中，盖紧瓶盖，室温保存。
48.实验例1.丝状真菌染色
49.取培养好的丝状真菌玻片样本，分别滴加1滴实施例1-3、对比例1-3的真菌染色液，10s后分别置于高倍镜、低倍镜及油镜显微镜下观察。结果如图1(低倍镜)、图2(高倍镜)、图3(油镜)所示，采用本技术所述的真菌染色液染色后，真菌及其孢子形态清晰，且操作简便。
50.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。