一种同时检测复杂基质样品中A型肉毒毒素和B型肉毒毒素的方法

本发明属于生物，尤其涉及一种同时检测复杂基质样品中a型肉毒毒素和b型肉毒毒素的方法。

背景技术：

1、肉毒神经毒素(botulinum neurotoxin，bont)是已知的最致命的生物毒素，它有a～h八种血清型，其中a、b、e、f四种血清型主要导致人类肉毒中毒，在已报道的病例中，又以a型和b型中毒最多。

2、目前肉毒毒素检测的金标准是小鼠致死试验(mouse lethality assay，mla)，体外检测有酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，elisa)、免疫层析法(immunochromatography assay，ica)、内肽酶活性试验(endopeptidase activityassay)、液相色谱质谱联用(liquid chromatography and mass spectrometry，lc-ms/ms)等。其中，lc-ms/ms不仅具有快速、高灵敏、样品需求量小等优点，且能鉴定至亚型，同时能够精准地进行定性和定量分析，为临床诊断提供依据。但是lc-ms/ms检测方法容易受样品中的复杂基质干扰。因此，迫切需要寻找一种能从复杂基质样品中同时捕获并富集a型肉毒毒素和b型肉毒毒素的抗体。

3、纳米抗体(nanobody，nb)是仅由一个重链可变区组成的单结构域抗体，其保留了重链抗体完整的抗原结合能力，同时具有分子质量小、组织穿透性强、抗原亲和力高、易于生产改造等优点。

技术实现思路

1、本发明的目的是检测含有复杂基质的样品中的a型肉毒毒素和/或b型肉毒毒素。

2、本发明首先保护ab-nbs抗体，其氨基酸序列如seq id no：1所示。

3、本发明还保护编码所述ab-nbs抗体的核酸分子。

4、所述编码所述ab-nbs抗体的核酸分子的核苷酸序列如seq id no：2所示。

5、所述ab-nbs抗体或上述任一所述编码所述ab-nbs抗体的核酸分子在检测样品中a型肉毒毒素和/或b型肉毒毒素中的应用也属于本发明的保护范围。

6、所述ab-nbs抗体或上述任一所述编码所述ab-nbs抗体的核酸分子在制备用于检测样品中a型肉毒毒素和/或b型肉毒毒素的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

7、上述应用中，所述样品可为含有复杂基质的样品；所述复杂基质容易干扰a型肉毒毒素和/或b型肉毒毒素的检测。

8、本发明还保护一种产品，其含有所述ab-nbs抗体或上述任一所述编码所述ab-nbs抗体的核酸分子。

9、所述产品由所述ab-nbs抗体或上述任一所述编码所述ab-nbs抗体的核酸分子组成。

10、本发明还保护一种检测样品中a型肉毒毒素和/或b型肉毒毒素的方法，可包括如下步骤：

11、(1)采用ab-nbs抗体捕获或富集样品中a型肉毒毒素和/或b型肉毒毒素，然后酶切，再用lc-ms/ms检测；所述ab-nbs抗体的氨基酸序列如seq id no：1所示。

12、(2)将a型肉毒毒素的特异性肽段混合，得到标准品a；将b型肉毒毒素的特异性肽段混合，得到标准品b；用lc-ms/ms检测标准品a和标准品b；

13、(3)比较步骤(1)和步骤(2)的lc-ms/ms检测结果，根据结果判断样品中是否含有a型肉毒毒素和/或b型肉毒毒素。

14、所述步骤(2)中，a型肉毒毒素的特异性肽段由yiydnr、iyingr、gymylk和lvasnwynr中的至少一种组成。b型肉毒毒素的特异性肽段由lyligsaeyek和/或vlqnfr组成。

15、所述步骤(3)中，根据检测结果判断样品中是否含有a型肉毒毒素和/或b型肉毒毒素的判断标准如下：

16、如果a型肉毒毒素检测总离子流图中样品肽段出峰时间与标准品a肽段出峰时间一致、离子对响应程度一致且样品肽段离子对和标准品a肽段离子对出峰一致，则样品中含有a型肉毒毒素；

17、如果b型肉毒毒素检测总离子流图中样品肽段出峰时间与标准品b肽段出峰时间一致、离子对响应程度一致且样品肽段离子对和标准品b肽段离子对出峰一致，则样品中含有b型肉毒毒素。

18、上述方法中，所述样品可为含有复杂基质的样品；所述复杂基质容易干扰a型肉毒毒素和/或b型肉毒毒素的检测。

19、实验证明，利用本发明提供的ab-nbs抗体可以从同一样品中捕获到a型肉毒毒素和b型肉毒毒素，降低了样品中复杂基质对检测结果的影响。本发明具有重要的应用价值。

技术特征：

1.ab-nbs抗体，其氨基酸序列如seq id no：1所示。

2.编码权利要求1所述ab-nbs抗体的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述编码权利要求1所述ab-nbs抗体的核酸分子的核苷酸序列如seq id no：2所示。

4.权利要求1所述ab-nbs抗体或权利要求2或3所述核酸分子在检测样品中a型肉毒毒素和/或b型肉毒毒素中的应用。

5.权利要求1所述ab-nbs抗体或权利要求2或3所述核酸分子在制备用于检测样品中a型肉毒毒素和/或b型肉毒毒素的产品中的应用。

6.根据权利要求4或5所述的核酸分子，其特征在于：所述样品为含有复杂基质的样品；所述复杂基质容易干扰a型肉毒毒素和/或b型肉毒毒素的检测。

7.一种产品，其含有权利要求1所述ab-nbs抗体或权利要求2或3所述核酸分子。

8.一种检测样品中a型肉毒毒素和/或b型肉毒毒素的方法，包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，a型肉毒毒素的特异性肽段由yiydnr、iyingr、gymylk和lvasnwynr中的至少一种组成；b型肉毒毒素的特异性肽段由lyligsaeyek和/或vlqnfr组成。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，根据检测结果判断样品中是否含有a型肉毒毒素和/或b型肉毒毒素的判断标准如下：

技术总结
本发明公开了一种同时检测复杂基质样品中A型肉毒毒素和B型肉毒毒素的方法。该方法通过采用AB‑Nbs抗体捕获或富集样品中A型肉毒毒素和/或B型肉毒毒素，之后酶切，液相色谱质谱联用检测实现，AB‑Nbs抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。实验证明，利用AB‑Nbs抗体可以从同一样品中捕获到A型肉毒毒素和B型肉毒毒素，降低了样品中复杂基质对检测结果的影响。本发明具有重要的应用价值。

技术研发人员：辛文文,康琳,吕若梅,吕晶,王景林,王菁,李佳欣,高姗,李岩伟
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11