采用蔗糖密度梯度超速离心测定口蹄疫病毒样颗粒的方法与流程

本发明属于口蹄疫病毒样颗粒抗原定量分析，特别是涉及采用蔗糖密度梯度超速离心测定口蹄疫病毒样颗粒的方法。

背景技术：

1、口蹄疫是一种急性、热性、高度传染性疾病，自然宿主广泛，能够感染牛、猪、羊等牲畜和其他野生动物，严重威胁世界牲畜产业及动物产品国际贸易。灭活疫苗是目前使用的主要疫苗，在防控方面发挥了重要作用，但灭活疫苗在生产过程中动用活毒有散毒隐患，且不能区分感染动物和免疫动物（3b缺失的口蹄疫全病毒标记疫苗虽可进行感染动物和免疫动物的精准鉴别，但其生产还需动用活病毒），已呈现出不符合我国现阶段口蹄疫防控要求的趋势。

2、病毒样颗粒由病毒的一种或多种结构蛋白组成，其进入免疫细胞和诱发免疫反应的机制均和全病毒相似，由于不存在核酸而无感染性。2021年9月，大肠杆菌系统表达、自组装的由口蹄疫结构蛋白vp0、vp1和vp3组成的口蹄疫vlps疫苗获得国家一类新兽药证书。病毒样颗粒疫苗的优势是生产不需动用活毒，生产成本低，生产效率高，并能区分感染和免疫动物，且免疫效力高于灭活疫苗，被行业认为是取代现有灭活疫苗的最有力候选者。

3、疫苗的保护效果主要取决于疫苗毒株与流行毒株的同源性以及疫苗中的抗原含量，病毒样颗粒的含量是决定口蹄疫病毒样颗粒疫苗质量和免疫效力的关键性因素。目前，还无有关口蹄疫病毒样颗粒含量定量方法的相关报导，由于病毒样颗粒结构和全病毒的相似性，可借鉴口蹄疫病毒的定量技术，但由于人工组装口蹄疫病毒样颗粒的不均一性，故不能全部套用口蹄疫病毒的定量技术。我国目前推广的口蹄疫病毒粒子的定量方法主要有“尺寸排阻高效液相色谱柱测定口蹄疫抗原146s”及“蔗糖密度梯度离心定量口蹄疫146s”，由于口蹄疫病毒样颗粒没有核酸，其分子量小于全病毒，故在蔗糖中的浮密度也小于口蹄疫病毒，被成为75s，从理论上推断口蹄疫病毒样颗粒在尺寸排阻高效液相色谱柱技术和蔗糖密度梯度离心的出峰位置均要晚于全病毒。利用尺寸排阻高效液相色谱柱测定口蹄疫病毒样颗粒含量时发现，在口蹄疫病毒出现的位置并没有出峰，由于人工组装口蹄疫病毒样颗粒的不均一性，导致病毒样颗粒和单体、聚集体的区分比较困难，且由于高效液相系统的高压力对病毒样颗粒的结构可能存在破坏，致使其检测准确性受限。蔗糖密度梯度离心是分离病毒的一种经典方法，其作用条件相对温和，但病毒样颗粒的出峰位置与全病毒存在差异，故分离病毒样颗粒的蔗糖梯度及条件与全病毒均有差异，而传统的蔗糖密度梯度离心方法全部采用手工操作，重复性较差。

4、因此，有必要对现有技术进行改进，以解决上述技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供采用蔗糖密度梯度超速离心测定口蹄疫病毒样颗粒的方法，蔗糖密度梯度超速离心法的作用条件温和，对病毒样颗粒的破坏较小，优化的蔗糖梯度和离心条件，使蔗糖密度梯度的分辨率更高，可将聚集体、病毒样颗粒和单体及杂蛋白完全区分；高效液相色谱仪的特殊使用减少了压力对病毒样颗粒的破坏和人为主观判断对结果的影响，提高了检测的敏感性、准确性，保证了结果的重复性。本方法可用于口蹄疫病毒样颗粒组装效率的测定及监测多种口蹄疫病毒样颗粒疫苗的抗原含量，间接评价疫苗效力。

2、为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

3、本发明为采用蔗糖密度梯度超速离心测定口蹄疫病毒样颗粒的方法，测定方法具体包括以下步骤；

4、s1：用ph8.0的tne缓冲液分别配制20%和45%的蔗糖溶液；取规格为4.5ml的超速离心管，通过梯度混合仪自带的刻度尺对超速离心管进行标记；先将20%的蔗糖溶液加入超速离心管至标记处，再用长针头将45%的蔗糖溶液从底部加入超速离心管至顶部；将装有蔗糖梯度溶液的超速离心管至于梯度混合仪中，选择20%-45%蔗糖梯度制备程序，连续工作90s，得20%-45%连续梯度的蔗糖溶液；

5、s2：取口蹄疫病毒样颗粒组装混合液，通过高速离心机以8000rpm离心3min，取上清液备用；先从制备好的蔗糖梯度溶液顶层吸取废液400µl，再加入500µl上清液，并在10℃条件下通过超速离心机以35000rpm离心3.5h，得离心样品；

6、s3：用末端带有15cm长针头且管径为0.5mm的管路将高效液相色谱仪的泵头和外部超速离心管相连，打开高效液相色谱仪的泵送系统和紫外检测系统，以45%的蔗糖溶液为流动相，平衡基线；

7、s4：将长针头插入到含有离心样品的超速离心管底部；打开泵系统，设定流速为0.28ml/min，检测波长设定为280nm和259nm,色谱仪的电脑系统自动绘制浓度曲线；

8、s5：将甲状腺球蛋白标准蛋白用缓冲液在12.5-200µg/ml浓度范围间配置成6个浓度梯度的标准溶液样品；取标准溶液样品0.5ml，代替口蹄疫病毒样颗粒组装混合液按步骤s1-s3进行操作后，将长针头插入到含有标准溶液样品的高速离心管的管底；打开泵系统，以0.28ml/min的流速运行，在280nm紫外波长下进行检测，对蛋白的吸收峰进行积分得峰面积，并建立峰面积与浓度的线性回归方程；

9、s6：根据s5中建立的蛋白浓度与峰面积的线性回归方程，将口蹄疫病毒样颗粒组装混合液吸收峰的积分面积代入回归方程，计算待测样品中病毒样颗粒的含量。

10、进一步地，步骤s1中，在梯度混合仪使用前，应通过水平仪将梯度混合仪调至平衡。

11、进一步地，步骤s3中，还通过去离子水为流动相，用于排出系统内的气泡。

12、进一步地，测定方法用于口蹄疫a型病毒样颗粒组装混合液和口蹄疫o型病毒样颗粒组装混合液的检测。

13、进一步地，测定方法还用于乳化的口蹄疫病毒样颗粒疫苗的检测。

14、本发明具有以下有益效果：

15、本发明的重复性好，批次内误差小，蔗糖密度梯度的配置采用全自动梯度仪制备，病毒样颗粒的出峰分析利用高效液相色谱系统实现全自动分析，相对传统密度梯度离心的人工操作误差小，检测结果更准确，具有广泛的适用性，可用于检测不同血清型的口蹄疫病毒样颗粒，解决了当前口蹄疫病毒样颗粒抗原无定量检测方法的难题，且克服了传统传统蔗糖密度梯度超速离心法重复性差、分析过程复杂的问题，对我国口蹄疫病毒样颗粒疫苗的质量控制及生产工艺的合理性均有重要意义。

技术特征：

1.采用蔗糖密度梯度超速离心测定口蹄疫病毒样颗粒的方法，其特征在于：测定方法具体包括以下步骤；

2.如权利要求1所述的采用蔗糖密度梯度超速离心测定口蹄疫病毒样颗粒的方法，其特征在于：步骤s1中，在梯度混合仪使用前，应通过水平仪将梯度混合仪调至平衡。

3.如权利要求2所述的采用蔗糖密度梯度超速离心测定口蹄疫病毒样颗粒的方法，其特征在于：步骤s3中，还通过去离子水为流动相，用于排出系统内的气泡。

4.如权利要求1或3所述的采用蔗糖密度梯度超速离心测定口蹄疫病毒样颗粒的方法，其特征在于：测定方法用于口蹄疫a型病毒样颗粒组装混合液和口蹄疫o型病毒样颗粒组装混合液的检测。

5.如权利要求4所述的采用蔗糖密度梯度超速离心测定口蹄疫病毒样颗粒的方法，其特征在于：测定方法还用于乳化的口蹄疫病毒样颗粒疫苗的检测。

技术总结
本发明公开了采用蔗糖密度梯度超速离心测定口蹄疫病毒样颗粒的方法，涉及口蹄疫病毒样颗粒抗原定量分析技术领域。本发明具体包括以下步骤：用自动梯度混合仪制备20%‑45%的蔗糖梯度，将500µl口蹄疫病毒样颗粒置与蔗糖梯度顶部；在10℃条件下以38000rpm离心3.5h分离病毒样颗粒；将超速离心管和高效液相色谱仪相连，以色谱仪的泵头为驱动力，检测流速为0.28 ml/min；采用紫外和激光检测器连续检测蔗糖梯度溶液的光学信号，通过计算机软件系统分析样品的出峰面积；根据甲状腺球蛋白标准品紫外吸收峰面积和蛋白浓度的回归方程计算病毒样颗粒的含量。本发明可用于口蹄疫病毒样颗粒组装效率测定及监测多种口蹄疫病毒样颗粒疫苗的抗原含量，间接评价疫苗效力。

技术研发人员：杜平,严欢,杨雪,刘鹏,钟丽君,刘潇,何清,田丽梅,于谦,段盛松,李峰,王俊,盛泽君
受保护的技术使用者：华宇生物科技（腾冲）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12