本发明涉及生物芯片,具体地说,是一种滴定法测量二氧化硅微球表面羟基含量的方法。
背景技术:
1、高密度基因芯片是一种成本低、检测位点量大、格式统一、分析快的基因检测手段。高密度生物芯片首先需要以二氧化硅微球作为寡核苷酸探针的固定载体,并使用硅板作为基因芯片的主要承载基体。未处理的二氧化硅微球表面连有一定数量的羟基基团,由于表面氨基基团的数量会影响后续反应步骤中微球表面所连的探针数量,探针数量将会影响检测结果的准确性。因此需要对表面羟基基团数量进行检测,微球表面羟基数量不明确,严重影响了对来料质量的控制和对下一步反应中氨基化效果的评估。
2、关于一种测量二氧化硅微球表面羟基含量的方法目前还未见报道。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种测量二氧化硅微球表面羟基含量的方法,通过滴定法对未修饰的微球进行表面羟基的定量。通过此方法,对未修饰的微球进行表面羟基的定量,帮助更好的对来料质量的控制和对后续反应效果的评估。
2、为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
3、本发明首次将滴定法引入微球来料质检中,对未修饰的微球进行表面羟基的定量,帮助更好的对来料质量的控制和对后续反应效果的评估。
4、未处理的二氧化硅微球所连羟基含量不易直接检测,而2,4-甲苯二异氰酸酯能够与羟基反应,反应计量比确定,且2,4-甲苯二异氰酸酯能够与二乙基胺进行反应,反应计量比确定。二乙基胺在以溴甲酚绿作为指示剂时,可用盐酸进行滴定。故采用在未处理的二氧化硅微球粉末中加入过量2,4-甲苯二异氰酸酯和二乙基胺,并对二乙基胺滴定的方法,由最终消耗的盐酸含量,推算出二氧化硅微球所连羟基含量。羟基与滴定中消耗的盐酸的物质的量之比为1:1。
5、实验原理基于以下三个反应式(图1):
6、①一摩尔2,4-甲苯二异氰酸酯可以与两摩尔硅羟基反应生成碳酸硅酯键。
7、②一摩尔2,4-甲苯二异氰酸酯可以与两摩尔二乙基胺反应生成两摩尔的酰胺键;
8、③一摩尔二乙基胺可以与一摩尔氢离子结合生产带正电的离子。
9、由上述反应式可知,返滴定法中消耗的盐酸的物质的量,与未处理二氧化硅微球所连羟基的物质的量之比为1:1,因此可以由消耗的盐酸的量,计算出羟基含量。
10、本发明的第一方面,提供一种测量二氧化硅微球表面羟基含量的方法,采用在二氧化硅微球粉末中加入过量2,4-甲苯二异氰酸酯和二乙基胺,并对二乙基胺滴定的方法,由最终消耗的盐酸含量,推算出二氧化硅微球表面所连羟基含量。羟基与滴定中消耗的盐酸的物质的量之比为1:1。
11、进一步的,所述的方法包括以下步骤:
12、a、称取100mg二氧化硅微球于1.5ml离心管中,加入1ml 2,4-甲苯二异氰酸酯溶液和100μl n,n-二甲基环己胺溶液,振荡3-5小时;
13、b、将振荡好的混合微球悬浊液转移到25ml三角烧瓶中,加入1ml乙二胺溶液、2ml二甲苯、2ml异丙醇和3滴溴甲酚绿指示剂,摇晃均匀,用0.3mmol/l的盐酸进行滴定,记录消耗的盐酸量;
14、c、羟基含量计算:返滴定法中消耗的盐酸的物质的量,即为二氧化硅微球所连羟基的物质的量,由此计算出二氧化硅微球表面羟基含量。
15、进一步的,所述的2,4-甲苯二异氰酸酯溶液为1.22mg/ml 2,4-甲苯二异氰酸酯的二甲苯溶液。其配置方法为:取50μl 2,4-甲苯二异氰酸酯,用二甲苯定量至50ml。
16、进一步的,所述的n,n-二甲基环己胺溶液为4.26*10-3mg/ml n,n-二甲基环己胺的二甲苯溶液。其配置方法为:取25μl n,n-二甲基环己胺,加975μl二甲苯稀释到1ml配成原液;取10μl原液用二甲苯定容至50ml。
17、进一步的,所述的乙二胺溶液为1.0295mg/ml二乙基胺的二甲苯溶液。其配置方法为:取72.5μl二乙胺,用二甲苯定容至50ml。
18、进一步的,所述的溴甲酚绿指示剂为1g/l溴甲酚绿指示剂。其配置方法为:称取0.05g溴甲酚绿,溶于乙醇中,转移至50ml容量瓶中,定容。
19、进一步的,所述的二氧化硅微球可选经过酸化处理的二氧化硅微球。未处理的二氧化硅微球表面连有羟基,但长时间存放等原因会导致微球表面羟基失活,因此需要采取酸化处理,使羟基重新具有活性。如果不进行酸化,不会对定量本身造成影响,但是由于羟基数量直接影响所连探针的数量,并影响结果的准确性,探针数量越多,结果越准确,也即羟基数量越多,结果越准确,因此在基因芯片检测中,为了使微球表面上带有更多的羟基,长时间存放的微球使用前均会进行酸化处理。
20、在本发明的一个优选实施方式中,所述的酸化处理方法为:
21、称取二氧化硅微球500mg加入4ml玻璃瓶中,加入1.33ml浓硫酸,600μl双氧水,超声分散后放入90℃水浴中加热酸化处理1-4h;在15ml离心管中加入10ml无菌水,将酸化后的微球悬浮液加入离心管中,离心去上清,加入20ml无菌水清洗(2500×g,5min)8-12次。使用10ml无水乙醇(干燥)清洗1-5次,离心去上清;使用10ml二甲苯清洗2-5次,离心去上清;加入适量的二甲苯定容至5ml,转移到15ml玻璃样品瓶中储存;取出1ml(100mg)转移至15ml玻璃样品瓶,离心去上清,放入烘箱110℃,10-14h烘干。
22、本发明优点在于:
23、1、首次将滴定方法引入微球质检中,能够快速、准确的对来料微球进行质检,有效提高了检测的准确性。
24、2、使用了乙二胺、盐酸、2,4-甲苯二异氰酸酯等试剂进行滴定,通过记录消耗的盐酸量,可对微球所连羟基进行定量分析,能够通过控制每批微球中所连羟基数量的方式,有效控制每次检测时微球上所连的探针数量;并有助于后续反应的量化计算,节省其他实验试剂用量。
25、3、本发明的检测方法通过加热、离心、烘干、滴定等步骤,可简单、快捷,能够快速有效地对微球进行质检,提高检测效率。
1.一种测量二氧化硅微球表面羟基含量的方法,其特征在于,采用在二氧化硅微球粉末中加入过量2,4-甲苯二异氰酸酯和二乙基胺,并对二乙基胺滴定的方法,由最终消耗的盐酸含量,推算出二氧化硅微球表面所连羟基含量;二氧化硅微球表面羟基与滴定中消耗的盐酸的物质的量之比为1:1。
2.根据权利要求1所述的测量二氧化硅微球表面羟基含量的方法,其特征在于,所述的方法包括以下步骤:
3.根据权利要求1所述的测量二氧化硅微球表面羟基含量的方法,其特征在于,所述的2,4-甲苯二异氰酸酯溶液为1.22mg/ml 2,4-甲苯二异氰酸酯的二甲苯溶液。
4.根据权利要求1所述的测量二氧化硅微球表面羟基含量的方法,其特征在于,所述的n,n-二甲基环己胺溶液为4.26*10-3mg/ml n,n-二甲基环己胺的二甲苯溶液。
5.根据权利要求1所述的测量二氧化硅微球表面羟基含量的方法,其特征在于,所述的乙二胺溶液为1.0295mg/ml二乙基胺的二甲苯溶液。
6.根据权利要求1所述的测量二氧化硅微球表面羟基含量的方法,其特征在于,所述的溴甲酚绿指示剂为1g/l溴甲酚绿指示剂。
7.根据权利要求1所述的测量二氧化硅微球表面羟基含量的方法,其特征在于,所述的二氧化硅微球为经过酸化处理的二氧化硅微球。
8.根据权利要求7所述的测量二氧化硅微球表面羟基含量的方法,其特征在于,所述的酸化处理方法为: