一种用于检测幽门螺杆菌的光纤探针、LSPR传感器装置及制备方法

一种用于检测幽门螺杆菌的光纤探针、lspr传感器装置及制备方法
技术领域
1.本发明涉及光纤传感器技术领域，具体而言，涉及一种用于检测幽门螺杆菌的光纤探针、lspr传感器装置及制备方法。


背景技术：

2.幽门螺杆菌(helicobacter pylori，hp)是一种对生长条件要求十分苛刻的螺旋形革兰阴性菌，其生长缓慢，微需氧，需3天以上才可见菌落。幽门螺杆菌专性寄生于人胃黏膜，其在人群中的感染非常普遍，已知是慢性胃炎、十二指肠和胃溃疡、胃癌和胃粘膜相关淋巴组织(malt)淋巴瘤等一些病例的致病因素。幽门螺杆菌的主要感染途径有两种：一是人—人直接传播，具体包括粪—口、口—口两种方式；二是从环境中感染，食用不洁食物和水均会增加感染风险。幽门螺杆菌能够在多种水体中存活，海水、河水、地表水和污水中均可检测到幽门螺杆菌，因此介水传播是不可忽视的感染途径。目前幽门螺杆菌传感器多针对其dna进行检测，需要将核酸提取出来，因此操作较为繁琐。基于核酸适配体的光纤lspr传感器检测幽门螺杆菌无需提取核酸，从而可实现幽门螺杆菌的快速检测。
3.光纤局域表面等离子体共振(localized surface plasmon resonance，lspr)技术是将光纤与局域表面等离子体共振(lspr)相融合所形成的新技术，具有无标记，体积小，结构简单，易于集成，抗电磁干扰能力强，可长距离实时检测等特点。近年来，光纤lspr生物传感器引起了广泛的关注，已经应用于生物医学、药物筛选、食品安全和环境监测等领域。但是，传统的裸光纤lspr传感器的灵敏度不高，因此影响了其进一步应用。
4.光纤探头的几何形状对lspr传感器的灵敏度有重要影响，近年来，通过改变光纤的构型来提高lspr传感器的性能成为国内外科学家的研究热点之一。光纤探针的形状从最初的直形到u形，再到ω形，其折光灵敏度均得到了大幅提高。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种用于检测幽门螺杆菌的光纤探针、lspr传感器装置及制备方法以解决上述技术问题。
7.本发明是这样实现的：
8.本发明提供了一种用于检测幽门螺杆菌的光纤探针，
9.包括相互连接的传感区域和非传感区域，传感区域是指光纤的纤芯，且传感区域不含外设于纤芯表面的涂覆层和包层，传感区域的纤芯表面修饰有纳米材料，纳米材料上修饰有如seq id no.1所示核酸适配体和如seq id no.2所示间隔核酸；
10.纳米材料选自纳米金、纳米银或核壳结构金/银纳米球，传感区域的纤芯包括直行段及弯折段，弯折段的形状为j形。
11.核酸适配体的碱基序列如seq id no.1所示：
12.aggttaccaggaggaccctattctcgtgtatcgacgagatccagtga。
13.间隔核酸的碱基序列如seq id no.2所示：ccggccggccgg。间隔核酸为短的茎环结构，可以调节适配体密度，而且能有效防止核酸适配体核酸倒伏、有利于适配体与幽门螺杆菌结合，由此提高检测灵敏度。
14.发明人提供了一种新的j形光纤探针，相较于现有的u形或ω形光纤探针，j形光纤探针具有更高的折光灵敏度。通过对检测幽门螺杆菌的核酸适配体进行截短优化，有助于提高幽门螺杆菌检测的特异性和亲和力。将j形光纤探针与核酸适配体结合，使得光纤探针具有免标记、高灵敏度、高特异性和快速检测等特点。
15.通过对检测幽门螺杆菌的核酸适配体进行截短优化，可以提高核酸适配体对幽门螺杆菌的亲和力，并能减少核酸适配体的缠绕现象的发生，从而有助于提高幽门螺杆菌检测的灵敏度和特异性。因此，发明人提供的核酸适配体可以大幅提高检测的灵敏度、特异性、亲和力和便捷性。
16.此外，截短优化后的核酸适配体制备成本更低。
17.在本发明应用较佳的实施方式中，传感区域的纤芯表面修饰有纳米金，纳米金的粒径为在13-60nm之间，最优为40nm。
18.在本发明应用较佳的实施方式中，核酸适配体和间隔核酸均通过ploy a与纳米材料连接。相比于巯基修饰的适配体，ploy a修饰的适配体成本更低，也不需要使用tcep试剂进行活化，极大程度上简化了制备工艺。
19.在本发明应用较佳的实施方式中，j形是由ω形的纤芯弯曲对折制得。例如，将ω形的纤芯在火焰中，用镊子进一步弯曲对折，得到j形纤芯。j形包括不限于：形状上近似为j形。
20.在本发明应用较佳的实施方式中，非传感区域是指在纤芯的表面依次设置有涂覆层和包层的光纤，传感区域的纤芯的长度为2-5cm，优选为3cm，光纤为多模光纤，光纤的纤芯直径为125-1000μm，优选为600μm；光纤探针的长度为5-40cm。
21.例如传感区域的纤芯的长度为3-5cm，纤芯的芯径为125-800μm，光纤探针的长度为25-40cm。
22.本发明还提供了一种光纤探针的制备方法，其包括如下步骤：
23.将中间去除包层和涂覆层的光纤在火焰上弯曲为ω形的形状，然后再进行弯曲对折使得光纤的传感区域形成j形的形状；
24.将纳米金、纳米银或核壳结构金/银纳米球修饰在光纤的传感区域表面，然后将光纤的传感区域浸入经退火处理后的核酸适配体和间隔核酸的混合缓冲液中，孵育。
25.在本发明应用较佳的实施方式中，将纳米金修饰在光纤的传感区域表面包括：将光纤的传感区域浸入纳米金溶液中修饰2-3min。
26.在上述修饰时间内，可以获得比较好的修饰效果，使得光纤的传感区域均布纳米金。通过修饰，使得纳米金通过正负离子间的静电引力固定在光纤表面。
27.在一种可选的实施方式中，在纳米金溶液中修饰后还包括干燥步骤。通过干燥以使得纳米金结合更紧密。
28.在一种可选的实施方式中，干燥后，还包括将光纤的传感区域浸入丁二酸酐溶液中进行封闭反应，干燥。为减少非特异性吸附，发明人将光纤浸泡在丁二酸酐溶液中以封闭
未结合的氨基。
29.在一种可选的实施方式中，丁二酸酐溶液的浓度为8-12mm，最优为10mm。在上述浓度范围内能够起到较好的封闭效果。在一种可选的实施方式中，上述封闭的时间为6h-18h。例如过夜进行封闭反应。
30.在本发明应用较佳的实施方式中，退火处理包括：将核酸适配体和间隔核酸分别于95℃-100℃下加热1-5min，然后降温至室温后混合。
31.对核酸适配体进行退火处理，可以使得核酸适配体形成特异性的空间结构，可用于特异性捕获目标物。
32.在本发明应用较佳的实施方式中，将退火后的核酸适配体和间隔核酸的混合液用氯化钠溶液稀释制得核酸适配体混合溶液，至核酸适配体混合溶液的氯化钠浓度为400-500mm，核酸适配体混合溶液的中的核酸终浓度(总的核酸浓度)为1-1.2μm；
33.在一种可选的实施方式中，将表面修饰有纳米金的光纤插入适配体溶液中，在35-37℃下金属浴过夜。而后进行清洗去除未结合至光纤上的核酸适配体。
34.本发明还提供了一种光纤lspr传感器装置，其包括：光源、光纤探针、高分辨光谱仪、光纤跳线和计算机。
35.从光源发出的一束连续波长的光沿光纤跳线传播至光纤探针，光在覆盖有球形纳米金颗粒的探针处发生局域表面等离子体共振，共振吸收峰的波长和光强均发生改变，光信号经光谱仪处理后，在计算机端进行光谱数据分析。
36.使用上述的传感器进行检测时，首先将修饰有适配体的光纤探针接入仪器接口，开启仪器后，将光纤探针的弯折段(j形纤芯)浸入缓冲液中平衡，待吸光度达到稳定后，将弯折段置于不同浓度的幽门螺杆菌缓冲溶液中，实时监测半小时，制作标准曲线。然后在检测待测样本中的幽门螺杆菌的浓度时，将光纤探针的弯折段浸入待测样本中，根据lspr吸收峰处的吸光度计算幽门螺杆菌的浓度。
37.基于j形光纤探针和核酸适配体的lspr生物传感器，有助于实现样本中幽门螺杆菌的免标记、高灵敏度、高特异性的快速检测，本发明提供的传感器装置对保护公众健康具有重要意义。
38.本发明具有以下有益效果：
39.(1)本发明提供了一种新的j形光纤探针，相较于现有的u形或ω形光纤探针，j形光纤探针具有更高的折光灵敏度。
40.(2)通过对检测幽门螺杆菌的核酸适配体进行截短优化，有助于提高幽门螺杆菌检测的特异性和亲和力。
41.通过对检测幽门螺杆菌的核酸适配体进行截短优化，可以提高核酸适配体捕获幽门螺杆菌的亲和力，并能减少核酸适配体的缠绕现象的发生，从而有助于提高幽门螺杆菌的检测灵敏度和特异性。因此，发明人提供的核酸适配体可以大幅提高检测的灵敏度、特异性、亲和力和便捷性。此外，截短优化后的核酸适配体还有助于降低制备成本。
42.(3)将j形光纤探针与核酸适配体结合，使得光纤探针整体上具有免标记、高灵敏度、高特异性和快速检测等特点。
43.(4)与现有技术相比，本发明提供的光纤探针对样本进行检测时，对样本无需额外的前处理步骤，可以直接进检测分析。
44.(5)本发明的j形光纤传感器装置体积小、易于集成。检测过程可在室温下进行，无须额外的仪器，能满足幽门螺杆菌的现场检测的需求。
45.(6)本发明采用的检测原理为光纤上连接的核酸适配体与待测物质的特异性结合，对待测物质具有高度的特异性和亲和力。同时样品无需标记，减少了对样品的损坏和污染。
46.(7)本发明提供的光纤探针还能实时监测样品反应过程，能真实地反映幽门螺杆菌菌体细胞与核酸适配体的相互作用过程。
附图说明
47.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
48.图1为j形光纤探针的实物图；
49.图2为u形、ω形、j形光纤在系列浓度蔗糖溶液中测得的吸光度统计结果图；
50.图3为幽门螺杆菌核酸适配体二级结构示意图；
51.图4为五种适配体检测幽门螺杆菌的lspr信号(吸光度增加量)。n＝3；
52.图5为j形光纤lspr传感器检测不同浓度的幽门螺杆菌的时间监测图谱。图中数据均来自光纤在530nm处的吸光度。曲线a为空白对照，即光纤在缓冲液中的吸光度变化；曲线b-h分别为光纤在1.0
×
102cfu/ml、1.0
×
103cfu/ml、1.0
×
104cfu/ml、1.0
×
105cfu/ml、1.0
×
106cfu/ml、1.0
×
107cfu/ml和1.0
×
108cfu/ml的幽门螺杆菌溶液中吸光度随时间的变化；
53.图6为幽门螺杆菌与lspr信号的拟合曲线。n＝3；
54.图7方法特异性评价结果。a-f分别代表大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌和幽门螺杆菌。
具体实施方式
55.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
56.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
57.实施例1
58.本实施例提供了一种用于检测幽门螺杆菌的光纤探针以及制备方法。
59.具体地，光纤探针的制备方法如下：
60.(1)将光纤剪成25cm长的若干小段，在丁烷喷灯火焰外焰下烧去中间约3cm长的外皮(作为传感区域)，并将暴露出的石英纤芯在外层火焰中弯曲成ω形的纤芯(也即探头)，然后用镊子进一步弯曲对折，得到j形纤芯(即为弯折段)，如图1所示。接着烧去光纤两端约半厘米的外皮，并用金刚石砂纸打磨，使端口整齐平滑，以便后续将光纤两端严密地装入仪
器。
61.(2)在光纤进行功能化修饰之前，对所有的玻璃器皿和光纤中端去除了外皮的部分均置于王水中浸泡约10min，用超纯水清洗后烘干，之后按照以下步骤进行修饰：
62.配制食人鱼溶液(30％过氧化氢:浓硫酸的体积比＝3:7)，将j形纤芯浸入其中，在90℃烘箱中反应30min，使探针表面羟基化，再用超纯水洗净，超声处理5min，在70℃烘干10min；配制1％(v/v)3-aptms溶液(乙醇和乙酸5:2的体积混合后加入1％体积的3-aptms)，将羟基化的j形纤芯浸泡其中，反应15min以连接氨基；将光纤转移至乙醇中，超声处理15min，再转移至超纯水中超声处理5min，置于烘箱中烘干。
63.将j形纤芯浸泡在合成的纳米金溶液(纳米金的粒径为13-60nm)中修饰2min，使纳米金通过正负离子间的静电引力固定在光纤表面，超纯水清洗后，在90℃烘箱中干燥30min，使纳米金结合更紧密。为减少非特异性吸附，将光纤浸泡在10mm丁二酸酐溶液中过夜以封闭未结合的氨基，洗净并烘干。
64.(3)进行核酸适配体的修饰。
65.将可特异性结合幽门螺杆菌的适配体固定在光纤表面的纳米金上用以捕获待测dna。
66.本实施例采用polya修饰的适配体，相比巯基修饰的适配体，成本更低，也不需要使用tcep试剂活化。
67.实验步骤如下：首先对适配体进行退火处理，使其形成特异性的空间结构从而实现目标物的特异性捕获，核酸适配体和间隔核酸的混合摩尔比为1:2，核酸适配体(a5)和间隔核酸的序列分别如seq id no.1所示和如seq id no.2所示，seq id no.1所示的核酸适配体从对比例4所示的apt1适配体两端各去除一部分引物，保留了可以与中间片段形成二级结构的部分(47bp)。用结合缓冲液将适配体稀释到2μm，于95℃下加热5min，然后缓慢降温至室温；加入等体积1mol/l的nacl溶液，使适配体溶液的终浓度为1μm、盐浓度为500mm；将修饰了纳米金的j形纤芯浸泡到适配体溶液中，在37℃金属浴中过夜。此后，用结合缓冲液清洗探针后浸泡在缓冲液中待用。
68.本实施例还提供了一种光纤lspr传感器装置，其由钨灯光源、j形光纤探针、高分辨光谱仪、光纤跳线和计算机(分析软件)组成。从光源发出的一束连续波长的光沿光纤跳线传播至光纤探针，光在覆盖有球形纳米金颗粒的j形探头处发生局域表面等离子体共振，共振吸收峰的波长和光强均发生改变，光信号经光谱仪处理后，在计算机端进行光谱数据分析。
69.使用此传感器进行检测时，首先将修饰有适配体的j形光纤接入仪器接口，开启仪器后，将j形纤芯浸入结合缓冲液中平衡，待吸光度达到稳定后，将探头置于不同浓度的幽门螺杆菌缓冲溶液中，实时监测半小时。制作标准曲线。然后在检测待测样本中的幽门螺杆菌的浓度时，将光纤探针的弯折段浸入待测样本中，根据lspr吸收峰处的吸光度计算幽门螺杆菌的浓度。
70.实施例2
71.与实施例1相比，区别仅在于纤芯表面修饰物不同，本实施例为纳米银核酸适配体。
72.实施例3
73.与实施例1相比，区别仅在于纤芯表面修饰物不同，本实施例为核壳结构金/银纳米球核酸适配体。
74.对比例1
75.本对比例与实施例1区别仅在于，步骤(1)中将光纤折弯成u形，采用u形光纤进行探针的制备，接着烧去光纤两端约半厘米的外皮，并用金刚石砂纸打磨，使端口整齐平滑，以便后续将光纤两端严密地装入仪器。其余步骤相同。
76.对比例2
77.本对比例与实施例1区别仅在于，步骤(1)中将光纤折弯成ω形，采用ω形光纤进行探针的制备，接着烧去光纤两端约半厘米的外皮，并用金刚石砂纸打磨，使端口整齐平滑，以便后续将光纤两端严密地装入仪器。其余步骤相同。
78.对比例3
79.本对比例与实施例1区别仅在于，采用巯基修饰核酸适配体，其余步骤相同。
80.适配体是本实验所构建的传感器中的关键元件，截短适配体的长度可剔除其非必需的序列，不仅能提高亲和力和检测灵敏度、降低合成成本，而且可有效避免因序列过长导致在固体表面缠绕而遮蔽结合位点，幽门螺杆菌核酸适配体二级结构参照图3所示，以下对比例4-7实验共截取了4个不同的适配体序列，通过实验进行比较和筛选。其中，中间的特异性序列是必须保留的，4个序列不同之处在于前后引物的截取。
81.对比例4
82.本对比例与实施例1区别仅在于，核酸适配体的序列不同，为截短前的核酸适配体，wu的团队在2021年报道了其筛选出的幽门螺杆菌的适配体，共80个碱基，包括20bp的前后引物和中间40bp的特异序列。即包含了前后引物(前+中+后，80bp)，核酸适配体的序列如下：
83.apt1(a1)：
84.aaggagcagcgtggaggttaccaggaggaccctattctcgtgtatcgacgagatccagtgaccacgacgacacaccctaa。
85.对比例5
86.本对比例与实施例1区别仅在于，核酸适配体的序列不同，apt2去掉了后引物(前+中，60bp)；核酸适配体的序列如下：
87.apt2(a2)：
88.aaggagcagcgtggaggttaccaggaggaccctattctcgtgtatcgacgagatccagtg。
89.对比例6
90.本对比例与实施例1区别仅在于，核酸适配体的序列不同，apt3去掉了前引物(中+后，60bp)；核酸适配体的序列如下：
91.apt3(a3)：
92.ccaggaggaccctattctcgtgtatcgacgagatccagtgaccacgacgacacaccctaa。
93.对比例7
94.本对比例与实施例1区别仅在于，核酸适配体的序列不同，apt4去掉了前后引物(中，40bp)；核酸适配体的序列如下：
95.apt4(a4)：
96.ccaggaggaccctattctcgtgtatcgacgagatccagtg。
97.发明人对比实施例1以及对比例4-7的适配体序列检测幽门螺杆菌的检测效果，并分别在适配体的5’端增加一段polya10，按照实施例1的步骤，退火后连接到光纤表面的aunp上，浸入结合缓冲液中，待吸光度稳定后，将探头置于1.0
×
105cfu/ml的幽门螺杆菌溶液中，监测吸光度的变化情况。结果如图4所示，a1信号最高，a5次之，二者相差不大，综合考虑，选择实施例1的核酸适配体作为后续实验用适配体。
98.实验例1
99.本实验例对实施例1的光纤探针进行灵敏度和特异性检测。
100.j形光纤lspr传感器的灵敏度
101.在优化条件下，本实验进一步检测了j形光纤lspr传感器对系列浓度幽门螺杆菌的响应。如图5所示，随幽门螺杆菌的浓度的增大，光纤lspr传感器的共振峰最大吸收也逐渐升高。以30min处lspr吸光度对幽门螺杆菌浓度对数值作线性拟合校正，结果如图6所示，光纤lspr响应值与幽门螺杆菌浓度在1.0
×
102cfu/ml到1.0
×
108cfu/ml的范围内线性良好，回归方程为y＝0.01646x-0.02646，r2＝0.9887，检出限为45.23cfu/ml，在无信号放大手段的情况下直接检测幽门螺杆菌，达到了较好的灵敏度。
102.j形光纤lspr传感器的特异性
103.为考察所建立传感器的特异性，在对目标菌——幽门螺杆菌进行测定的同时，也分别检测了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和单增李斯特菌。光纤探头在空白缓冲液中平衡至吸光度稳定后，将光纤探头置于1.0
×
105cfu/ml的菌液中，实时监测lspr共振吸收峰的变化，如图7所示，本实验所构建传感器检测上述非目标菌时，吸光度值改变远低于幽门螺杆菌，表明此传感器在幽门螺杆菌检测中有良好的特异性。
104.分别对实施例1和对比例1-2在不同浓度的蔗糖溶液中进行吸光度检测，参照图2所示，图中三条曲线a、b、c分别代表j形、ω形、u形光纤的ris曲线。结果显示实施例1提供的光纤探针具有更高的灵敏度。
105.研究比较了u形、ω形和j形光纤的ris：制备u形、ω形和j形光纤各3支，按照实施例1的步骤对光纤中端去除外皮的探头部分进行羟基化、氨基化处理，而后使用na3ct与haucl4体积比为3:1制备的纳米金溶液修饰三种光纤至相同的吸光度增量(修饰前后的吸光度差值均为1od)，并高温固定，将光纤探头分别浸于质量浓度为0％、4％、8％、12％、16％、20％的蔗糖溶液中，测定并记录其吸光度值，将吸光度与相应的蔗糖折光率进行线性拟合，拟合曲线的斜率即为该光纤的折光灵敏度ris。三种形状的光纤在不同浓度的蔗糖溶液中的共振吸收光谱以及各自的ris如图2所示，三种形状的光纤在固定波长下的吸光度均随蔗糖浓度的增加而线性增加；j形光纤吸光度变化幅度显著高于u形、ω形光纤。经拟合计算，u形光纤的ris为13.72(a.u.)/riu，ω形光纤的ris为21.13(a.u.)/riu，j形光纤的ris为39.71(a.u.)/riu，因此本实验首次提出的j形光纤具有最高的折光灵敏度。
106.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。