一种提取土壤中负载生物膜微塑料的方法

1.本发明涉及土壤化学相关领域，尤其涉及一种提取土壤中负载生物膜微塑料的方法。


背景技术：

2.微塑料污染问题已受到全球的关注。环境中微塑料不仅对生物的健康构成威胁，同时还可作为微生物的载体。土壤中的微生物附着在微塑料颗粒表面形成生物膜，这可能会改变微塑料原本的组成、结构、性质与功能等，因此分离提取附着生物膜的微塑料对于人们研究微塑料的环境行为和提供微塑料研究的基础数据等都是非常重要的。国内外关于土壤微塑料及其表面微生物或生物膜的研究还非常有限，且可用于分离土壤中负载生物膜微塑料方法还十分缺乏。因此，在我国开展土壤微塑料表面生物膜的形成及其对微塑料理化性质影响的研究以及有效分离土壤中负载生物膜微塑料的方法具有重要的科学价值和现实意义。
3.土壤与微塑料分离的传统方法有盐溶液浮选法，主要分离步骤包含悬液搅拌、连续流动及气浮溢流几部分，传统的试验方法不足之处在于操作可能会破坏微塑料颗粒表面生物膜的结构与组成，进而改变其性质与功能；所用装置结构复杂，操作繁琐。


技术实现要素：

4.因此，为了解决上述不足，本发明提供一种提取土壤中负载生物膜微塑料的方法。
5.为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种提取土壤中负载生物膜微塑料的方法，包括以下步骤：s1灭菌：将提取仪器进行灭菌处理；s2浸泡浮选：采用超净工作台，取土壤样本放入离心管中，加入无菌水浸泡使土壤变得松软，成稀泥状，再浮选微塑料；s3振荡分离：将装有样本的离心管放入进行振荡处理，使微塑料颗粒从土壤颗粒中脱落，完毕后将离心管进行离心处理，使微塑料与土壤分离；s4过滤清洗：在超净工作台内，将离心后的上清液倒入布氏漏斗用无菌滤膜进行抽滤，同时用无菌水冲洗布氏漏斗内壁附着的微塑料颗粒，再用灭菌水清洗微塑料表面，去除微塑料表面附着的杂质或浮游微生物；s5收集颗粒：用无菌药匙刮下滤膜上附的微塑料颗粒，装入无菌离心管中，放入冰箱冷藏，待进一步分析表面生物膜。
6.优选的，步骤s1中所述提取仪器为玻璃仪器、离心管、药匙、布氏漏斗等仪器。
7.优选的，步骤s2中所述土壤样本为10g，离心管采用100ml，加50ml无菌水浸泡4h土壤，浮选微塑料20h。
8.优选的，步骤s3中所述振荡处理的方法是采用振荡器，离心处理的方法是采用离心机。
9.优选的，步骤s3中所述振荡方式为100r/min振荡60min，所述离心方式为4000r/min离心30min。
10.优选的，步骤s4中所述无菌滤膜直径50mm、孔径0.45μm。
11.优选的，步骤s4中所述灭菌水清洗微塑料表面次数为3次。
12.优选的，步骤s5中所述无菌离心管采用10ml，冷藏温度为4℃。
13.本发明的有益效果：
14.本发明通过采用浸泡浮选、振荡分离及过滤清洗方法来对土壤中负载生物膜微塑料进行提取，改进传统方法，具有保持颗粒表面原有微生物组成与结构、操作时间短、操作简单、回收率高等优点，改善了传统的试验方法不足之处在于操作可能会破坏微塑料颗粒表面生物膜的结构与组成，进而改变其性质与功能；所用装置结构复杂，操作繁琐的问题。
附图说明
15.图1是本发明流程示意图。
具体实施方式
16.为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例进行详细阐述。
17.请参阅图1，本发明提供一种提取土壤中负载生物膜微塑料的方法：
18.s1)灭菌：将玻璃仪器、离心管、药匙、布氏漏斗等所有用到的仪器要灭菌处理，使得在无菌环境下进行整改操作，避免细菌入侵导致后续提取微生物受污染；
19.s2)浸泡浮选：在超净工作台内，取10g样本放入100ml离心管中，加50ml无菌水浸泡4h使土壤变得松软，成稀泥状，再浮选微塑料20h，利用无菌的超净工作台和无菌水，有效的避免外部细菌入侵；
20.s3)振荡分离：将装有样本的离心管放入振荡器中,以100r/min振荡60min使微塑料颗粒从土壤颗粒中脱落,完毕后将离心管放入离心机以4000r/min离心30min，使微塑料与土壤分离，采用振荡和离心方式双重操作，可有效快速的将微塑料与土壤进行分离，且此操作可便于脱离后的微塑料颗粒完整的提取；
21.s4)过滤清洗：在超净工作台内，将离心后的上清液倒入布氏漏斗，用直径50mm、孔径0.45μm无菌滤膜进行抽滤，同时用无菌水冲洗布氏漏斗内壁附着的微塑料颗粒。再用灭菌水清洗微塑料表面3次，去除微塑料表面附着的杂质或浮游微生物，同样如上述步骤均采用超净工作台，且利用无菌滤膜和灭菌说，整体步骤均在无菌环境下进行，来对微塑料表面杂质和浮游微生物进行去除，以得到完整微塑料颗粒及其表面的生物膜；
22.s5)收集颗粒：用无菌药匙小心刮下滤膜上附的微塑料颗粒，装入10ml无菌离心管中，放入冰箱4℃冷藏，待进一步分析表面生物膜，同样如上述步骤中为无菌器械操作，实现无菌提取微塑料颗粒，来保持颗粒表面原有微生物组成与结构。
23.以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。


技术特征：
1.一种提取土壤中负载生物膜微塑料的方法，其特征在于：包括以下步骤：s1灭菌：将提取仪器进行灭菌处理；s2浸泡浮选：采用超净工作台，取土壤样本放入离心管中，加入无菌水浸泡使土壤变得松软，成稀泥状，再浮选微塑料；s3振荡分离：将装有样本的离心管放入进行振荡处理，使微塑料颗粒从土壤颗粒中脱落，完毕后将离心管进行离心处理，使微塑料与土壤分离；s4过滤清洗：在超净工作台内，将离心后的上清液倒入布氏漏斗用无菌滤膜进行抽滤，同时用无菌水冲洗布氏漏斗内壁附着的微塑料颗粒，再用灭菌水清洗微塑料表面，去除微塑料表面附着的杂质或浮游微生物；s5收集颗粒：用无菌药匙刮下滤膜上附的微塑料颗粒，装入无菌离心管中，放入冰箱冷藏，待进一步分析表面生物膜。2.根据权利要求1所述一种提取土壤中负载生物膜微塑料的方法，其特征在于：步骤s1中所述提取仪器为玻璃仪器、离心管、药匙、布氏漏斗等仪器。3.根据权利要求1所述一种提取土壤中负载生物膜微塑料的方法，其特征在于：步骤s2中所述土壤样本为10g，离心管采用100ml，加50ml无菌水浸泡4h土壤，浮选微塑料20h。4.根据权利要求1所述一种提取土壤中负载生物膜微塑料的方法，其特征在于：步骤s3中所述振荡处理的方法是采用振荡器，离心处理的方法是采用离心机。5.根据权利要求4所述一种提取土壤中负载生物膜微塑料的方法，其特征在于：步骤s3中所述振荡方式为100r/min振荡60min，所述离心方式为4000r/min离心30min。6.根据权利要求1所述一种提取土壤中负载生物膜微塑料的方法，其特征在于：步骤s4中所述无菌滤膜直径50mm、孔径0.45μm。7.根据权利要求1所述一种提取土壤中负载生物膜微塑料的方法，其特征在于：步骤s4中所述灭菌水清洗微塑料表面次数为3次。8.根据权利要求1所述一种提取土壤中负载生物膜微塑料的方法，其特征在于：步骤s5中所述无菌离心管采用10ml，冷藏温度为4℃。

技术总结
本发明公开了一种提取土壤中负载生物膜微塑料的方法，本发明通过采用浸泡浮选、振荡分离及过滤清洗方法来对土壤中负载生物膜微塑料进行提取，改进传统方法，具有保持颗粒表面原有微生物组成与结构、操作时间短、操作简单、回收率高等优点，有效避免传统的试验方法不足之处，改善了操作可能会破坏微塑料颗粒表面生物膜的结构与组成，进而改变其性质与功能；所用装置结构复杂，操作繁琐的问题。操作繁琐的问题。操作繁琐的问题。


技术研发人员：邹继颖 刘辉 魏嘉 王建超
受保护的技术使用者：吉林化工学院
技术研发日：2022.10.17
技术公布日：2023/1/17