一种无标记磁珠平面显微计数的数字免疫分析方法与流程

本发明涉及生物样本中目的抗原/抗体的免疫检测方法，具体涉及一种无标记磁珠平面显微计数的数字免疫分析方法。

背景技术：

1、目前生物样本中目的抗原/抗体的免疫检测方法有酶联免疫法、侧向流免疫层析、微粒子化学发光法、微粒子荧光法及包括数字免疫的固相、液相生物芯片法。这些免疫检测方法大都是基于双抗夹心法免疫检测技术，用一抗特异性捕获生物样本中的目的抗原/抗体，并用标记了可致发光材料的二抗结合目的抗原/抗体；通过一定的激发方式得到可致发光材料发出的光信号，测定该光信号的强度，定性/定量地表征样本中目的抗原/抗体的含量。

2、酶联免疫法、侧向流免疫层析法为固相捕获免疫技术，用包被了一抗的反应管底或液流基底捕获样本中的目的抗原/抗体；微粒子化学发光法及微粒子荧光法为液相捕获免疫技术，利用包被了一抗的磁珠在样本中捕获目的抗原/抗体；标记目的抗原/抗体的光信号有可见光、自发荧光、化学激发荧光、电激发荧光及光激发荧光等，对应的可致发光材料有胶体金、各种荧光素、量子点、时间分辨荧光及上转换发光荧光等，光信号检测装置有ccd、cmose及pmt等。人们一直在寻求更灵敏的光探测器，制备具有更强、更稳定及更有辨识度的标记光信号及合适激发方式的化学试剂、反应方式，以提高检测的灵敏度。

3、一般地，光探测器检测的是整个反应体积的光强，当样本中目的抗原/抗体含量较低时，标记光信号相对较弱，光探测器无法从反应器中检测到光信号，这是免疫检测的灵敏度下限。生物芯片技术将大的反应体积分散为大量的小体积，用若干小体积单元表征总体积的目的抗原/抗体含量。如液相生物芯片通过流式荧光检测每颗微球、固相生物芯片则通过阅读在固相物质表面的抗体点阵/微球分布等荧光显微图像，以获得小体积单元的信息。当参与反应的小体积单元的捕获能力是微量的，且其参与反应的数量远大于需要的捕获单元数量，这些小体积单元按照泊松分布原理捕获样本中的目的抗原/抗体，识别并计数所有捕获到目的抗原/抗体的小体积单元，即可高灵敏地得到其表征的样本中目的抗原/抗体的含量，此方法为数字免疫检测技术。代表性地，quanterix的simoa技术用大量的磁珠捕获样本中的目的抗原/抗体，并进行荧光标记，将这些磁珠安置在2.38×105个刚好能容纳一颗磁珠的微孔中，光探测器检测到的为单个磁珠的信息，灵敏度为一颗磁珠捕获的目的抗原/抗体含量。

4、数字免疫技术的精髓在于能够从大量的阴阳混合的磁珠中以单颗磁珠的识别水平准确分辨并计数捕获了样本中目的抗原/抗体的阳性磁珠，由于单颗阳性磁珠的荧光信号不强，对光探测器灵敏度要求极高；同时，单层地铺设所有磁珠需要特制的抓捕平面，使得数字免疫技术实现的难度大、成本高。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种无标记磁珠平面显微计数的数字免疫分析方法，不采用荧光标记阳性磁珠，而是通过固相物质平面抓捕、纯化阳性磁珠，并显微计数阳性磁珠。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一方面是提供一种无标记磁珠平面显微计数的数字免疫分析方法，包括如下步骤：

4、步骤一，用大量包被了抗体/抗原的磁珠在第一反应管捕获样本中的目的抗原/抗体；

5、步骤二，在第二反应管管底预包被能结合已捕获目的抗原/抗体的磁珠的另一抗体/抗原；

6、步骤三，将步骤一中获得的反应液注入第二反应管中，震荡后，清洗反应管，反应管管底只留下单层的已捕获目的抗原/抗体的磁珠；

7、步骤四，显微镜或图像传感芯片拍摄第二反应管管底的全视野显微图像；ai识别、计数全视野显微图像中所有的磁珠。

8、进一步地，样本的体积为100-300μl。

9、进一步地，步骤一中，将进行捕获的磁珠逐步投放到样本中或以低浓度缓慢注入样本中。

10、进一步地，步骤一中，反应的条件是水浴、往复振荡。

11、进一步地，步骤一中，反应完成后，在磁场下清洗以去除样本中所有磁珠以外的物质，重悬，得到只含有阳性磁珠和阴性磁珠的反应液。

12、进一步地，上述磁珠的直径为0.5-10μm。

13、进一步地，上述第二反应管的管底为透明的平底。

14、进一步地，步骤四具体为：将第二反应管置于载物台，管底朝上，在载物台上切割出反应管管底的包被区域并置于载物台；用清洗缓冲液喷淋式清洗该包被区域内表面；反应管管底包被区域内表面朝向vps芯片感光面贴合，vps数字显微仪拍摄该区域的全视野显微图像，ai识别、计数全视野显微图像中所有的磁珠。

15、本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

16、本发明提供的一种无标记磁珠平面显微计数的数字免疫分析方法，定义捕获了样本中待测抗原/抗体的磁珠为阳性磁珠，未捕获样本中待测抗原/抗体的磁珠为阴性磁珠，本发明中，阳性磁珠不采用荧光进行标记，而是由预包埋在固相物体表面的二抗进行特异性地抓捕，因此，阳性磁珠不用被荧光标记就能被识别到；阳性磁珠代表的抗原/抗体含量不采用标记荧光的信号强度表征，而是由阳性磁珠的数量进行表征，即拍摄抓捕了阳性磁珠的物体平面的显微图像，以单颗磁珠的水平计数图像中所有的磁珠，这些磁珠的数量代表了该生物样本内待测抗原/抗体的含量。单颗阳性磁珠是表征样本中抗原/抗体含量的最小单元，按照泊松分布原理，参与捕获样本中抗原/抗体的磁珠是大量的，这些磁珠的数量代表了该生物样本内待测抗原/抗体的含量。本发明通过显微图像按单颗磁珠的水平计数阳性磁珠总数，实现了免疫检测的数字化，可极大地提高检测的灵敏度。

技术特征：

1.一种无标记磁珠平面显微计数的数字免疫分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的数字免疫分析方法，其特征在于，所述样本的体积为100-300μl。

3.根据权利要求1所述的数字免疫分析方法，其特征在于，步骤一中，将进行捕获的磁珠逐步投放到样本中或以低浓度缓慢注入样本中。

4.根据权利要求1所述的数字免疫分析方法，其特征在于，步骤一中，反应的条件是水浴、往复振荡。

5.根据权利要求1所述的数字免疫分析方法，其特征在于，步骤一中，反应完成后，在磁场下清洗以去除样本中所有磁珠以外的物质，重悬，得到只含有阳性磁珠和阴性磁珠的反应液。

6.根据权利要求1所述的数字免疫分析方法，其特征在于，所述磁珠的直径为0.5-10μm。

7.根据权利要求1所述的数字免疫分析方法，其特征在于，所述第二反应管的管底为透明的平底。

8.根据权利要求1所述的数字免疫分析方法，其特征在于，步骤四具体为：将第二反应管置于载物台，管底朝上，在载物台上切割出反应管管底的包被区域并置于载物台；用清洗缓冲液喷淋式清洗所述包被区域内表面；反应管管底包被区域内表面朝向vps芯片感光面贴合，vps数字显微仪拍摄所述区域的全视野显微图像，ai识别、计数全视野显微图像中所有的磁珠。

技术总结
本发明提供了一种无标记磁珠平面显微计数的数字免疫分析方法，包括：用大量包被了抗体/抗原的磁珠在第一反应管捕获样本中的目的抗原/抗体；在第二反应管管底预包被能结合已捕获目的抗原/抗体的磁珠的另一抗体/抗原；将步骤一中获得的反应液注入第二反应管中，震荡后，清洗反应管，反应管管底只留下单层的已捕获目的抗原/抗体的磁珠；显微镜或图像传感芯片拍摄第二反应管管底的全视野显微图像；AI识别、计数全视野显微图像中所有的磁珠。单颗阳性磁珠是表征样本中抗原/抗体含量的最小单元，本发明通过显微图像按单颗阳性磁珠的水平计数阳性磁珠总数，实现了免疫检测的数字化，可极大地提高检测的灵敏度。

技术研发人员：卢大骅,陈承燕,印长兵
受保护的技术使用者：南京九川科学技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13