一种检测三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫的方法

本发明属于水产养殖病害防控领域，具体的说是涉及一种利用dot-elisa检测三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫的方法。

背景技术：

1、血卵涡鞭虫是一类感染海洋甲壳动物的寄生甲藻，在全球范围内多种经济甲壳动物中造成流行性病害，并导致重大经济损失。近年来，血卵涡鞭虫引发的寄生甲藻流行病在我国沿海地区被持续报道和发现，严重影响和危害我国海水经济甲壳类养殖业的可持续、健康发展。自2004起，血卵涡鞭虫相继在我国浙江舟山海域、广东汕头海域、山东沿海以及渤海河北、天津海域的海捕或养殖经济甲壳动物中被报道发现。研究发现，血卵涡鞭虫是导致我国东南沿海养殖锯缘青蟹、浙江沿海及山东沿海养殖三疣梭子蟹大规模死亡的主要病原之一。其中，三疣梭子蟹是山东省的重要经济养殖物种，养殖面积近6000公顷，占全国总养殖面积的四分之一(2022中国渔业统计年鉴)。自2007年以来，山东沿海多个地市(青岛、日照、潍坊等)的虾蟹养殖区频繁爆发血卵涡鞭虫流行病“牛奶病”，在整个养殖周期(5-10月)内，养殖梭子蟹中持续存在血卵涡鞭虫感染(最高可达90％)，且大多数发病养殖池中的梭子蟹产量降低80％以上甚至绝产，造成重大经济损失。因此，针对血卵涡鞭虫流行病的早期预测预报及有效防控就显得十分重要。

2、在三疣梭子蟹养殖过程中，血卵涡鞭虫感染情况的实时监测对流行性病害“牛奶病”的早期预测预报和及时防控等具有重要意义。要实时、准确掌握养殖梭子蟹中的血卵涡鞭虫感染情况，则需要建立可现场应用的高效、灵敏的血卵涡鞭虫检测方法。通常对于三疣梭子蟹中血卵涡鞭虫的检测方法主要有血涂片法、组织病理学分析、pcr扩增和免疫荧光原位杂交(fish)等，以上检测方法适用于专业研究人员在实验室内对血卵涡鞭虫的检测分析，成本较高且均需要相应的仪器设备才能完成检测分析工作。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中的不足之处，实现对三疣梭子蟹养殖过程中血卵涡鞭虫流行病发生的早期预测预报，本发明提供了一种高效、直观、灵敏、特异、准确且低成本的一种利用dot-elisa检测三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫的方法。

2、为了解决技术问题，本发明采用的具体步骤是：

3、一种检测三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫的方法，采用dot-elisa方法，以通过抗体芯片杂交技术(委托上海艾比玛特生物医药有限公司，利用abmart抗体芯片mabarray 1.0)筛选获得的igg作为血卵涡鞭虫的特异性单克隆抗体，进而检测三疣梭子蟹被血卵涡鞭虫的感染情况。

4、所述血卵涡鞭虫的特异性单克隆抗体抗体的获得：将0.05g的血卵涡鞭虫细胞破碎，破碎后加入2ml的天然法裂解液和20μl蛋白酶抑制剂，充分裂解而后经超声处理，离心收集上清液即为抗原，将抗原进一步与抗体芯片进行抗原-抗体杂交反应，即获得特异性抗体；其中，破碎后细胞(g)、天然法裂解液(ml)和蛋白酶抑制剂(μl)之间按1:40:0.4的比例混合。

5、所述天然法裂解液为100mm tris-base，50mm nacl，50mm抗坏血酸钠，1％ np-40，1％ triton x-100，1％吐温-20，5mm edta和50mm四硼酸钠组成的混合液；蛋白酶抑制剂为终浓度为1mmpmsf和2mmedta的混合液；

6、所述超声处理为超声3-5秒，停顿10-20秒，反复进行30次。

7、所述经dot-elisa方法显色后呈现出深蓝色或蓝紫色，即为感染血卵涡鞭虫的三疣梭子蟹；感染数量与待检测总数量的比值，即为三疣梭子蟹感染率。

8、具体为：

9、(1)血淋巴样品研磨：取待检测三疣梭子蟹的血淋巴样品经氧化锆研磨珠充分研磨，离心收集上清液；

10、(2)将上述收集的上清液滴至活化后硝酸纤维素膜(nc)上，使nc膜吸收上清液，然后经1xtbst反复清洗膜片；

11、(3)封闭：将膜片置于细胞培养板内加入5％脱脂牛奶进行封闭，室温放置30-60min；

12、(4)孵育一抗：弃细胞培养板中的溶液，采用1xtbst反复洗涤，滴加稀释后的血卵涡鞭虫单克隆抗体覆盖nc膜，室温孵育45-60min；其中，血卵涡鞭虫单克隆抗体经含5％脱脂牛奶的pbst缓冲液稀释；所述血卵涡鞭虫单克隆抗体与缓冲液稀释体积比为1:1500-2500稀释；

13、(5)孵育二抗：弃去细胞培养板中的液体，采用1xtbst反复冲洗nc膜，滴加稀释后的羊抗鼠ap-igg二抗覆盖nc膜，室温孵育30-40min；其中，稀释液为含5％脱脂牛奶的pbst缓冲液，二抗与稀释液体积比为1：3000-4000；

14、(6)显色反应：弃掉溶液，1xtbst反复洗涤nc膜，然后将nc膜浸入显色反应工作液中，黑暗室温条件下，置于摇床上平缓摇动进行孵育反应20-30min后，将nc膜浸入去离子水中终止反应，然后将膜取出晾干，观察记录结果；nc膜中央处样品呈现出深蓝色或蓝紫色，说明三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫。

15、所述的5％脱脂牛奶为0.5g脱脂奶粉加入1xtbst，定容至10ml；显色反应工作液为40μl氯化硝基四氮唑兰(25×nbt)，1ml碱性磷酸酶反应缓冲液(1×ap)和40μl 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐溶液(25×bcip)组成的混合液。

16、所述待检测三疣梭子蟹的血淋巴样品为采用75％酒精棉球擦拭三疣梭子蟹第五游泳足关节膜进行消毒，然后使用1ml规格的无菌注射器抽取约200μl血淋巴液，液氮速冻后-80℃保存；

17、所述活化后硝酸纤维素膜(nc)为用打孔器将nc膜裁剪成直径为6mm大小的圆片；提前在48孔细胞培养板中加入100μl pbs缓冲液，将裁剪好的nc膜片依次加入孔板内浸泡20min激活nc膜；吸去细胞培养板中的pbs缓冲液，将nc膜放置约20min进行晾干，但切勿过于干燥；

18、本发明的有效益果：本发明针对三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫的血清学方法，由于使用高度特异性的血卵涡鞭虫特异性单克隆抗体，该检测方法特异性强、灵敏度高，适用于批量样品的现场检测，同时该检测方法不仅不需要特殊的仪器设备和较昂贵的试剂材料，节约了检测成本和时间；操作人员不需要具有相应的专业研究背景和技术即可完成检测工作。检测结果采用肉眼可辨别的显色反应，深蓝色或蓝紫色即为阳性结果，未显色即为阴性结果，检测结果直观、简单、可靠。利用本发明对养殖区三疣梭子蟹中的血卵涡鞭虫感染率进行实时调查、监测，准确把握养殖流行性病害“牛奶病”的发生进程，在三疣梭子蟹养殖过程中对血卵涡鞭虫流行病的爆发趋势进行早期预测预报，并为及时采取相应的防控措施提供技术支撑。

技术特征：

1.一种检测三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫的方法，其特征在于：采用dot-elisa方法，以通过抗体芯片杂交技术筛选获得的igg作为血卵涡鞭虫的特异性单克隆抗体，进而检测三疣梭子蟹被血卵涡鞭虫的感染情况。

2.按权利要求1所述检测三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫的方法，其特征在于：所述血卵涡鞭虫的特异性单克隆抗体抗体的获得：将0.05g血卵涡鞭虫细胞破碎，破碎后加入2ml天然法裂解液和20μl蛋白酶抑制剂，充分裂解而后经超声处理，离心收集上清液即为抗原，将抗原进一步加入抗体芯片进行抗原-抗体杂交反应，即筛选获得特异性抗体；其中，破碎后细胞(g)、天然法裂解液(ml)和蛋白酶抑制剂(μl)之间按1:40:0.4的比例混合。

3.按权利要求2所述检测三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫的方法，其特征在于：所述天然法裂解液为100mm tris-base，50mm nacl，50mm抗坏血酸钠，1％np-40，1％triton x-100，1％吐温-20，5mm edta和50mm四硼酸钠组成的混合液；蛋白酶抑制剂为终浓度为1mmpmsf和2mmedta的混合液；

4.按权利要求1所述检测三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫的方法，其特征在于：所述经dot-elisa方法显色后呈现出深蓝色或蓝紫色，即为感染血卵涡鞭虫的三疣梭子蟹；感染数量与待检测总数量的比值，即为三疣梭子蟹感染率。

5.按权利要求1或4所述检测三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫的方法，其特征在于：

6.按权利要求1或4所述检测三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫的方法，其特征在于：所述的5％脱脂牛奶为0.5g脱脂奶粉加入1xtbst，定容至10ml；显色反应工作液为40μl氯化硝基四氮唑兰(25×nbt)，1ml碱性磷酸酶反应缓冲液(1×ap)和40μl 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐溶液(25×bcip)组成的混合液。

技术总结
本发明属于水产养殖病害防控领域，具体的说是涉及一种利用Dot‑ELISA检测三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫的方法。采用Dot‑ELISA方法，以通过抗体芯片杂交技术筛选获得的IgG作为血卵涡鞭虫的特异性单克隆抗体，进而检测三疣梭子蟹被血卵涡鞭虫的感染情况。该检测方法具有特异性强、灵敏度高、结果容易辨别判定，且检测结果便于长期保存等特点，可对养殖三疣梭子蟹进行大规模的采样调查和检测，为三疣梭子蟹养殖过程中血卵涡鞭虫引发的“牛奶病”的流行发生进行预警预报，并为及时采取针对血卵涡鞭虫流行性病害的防控措施提供技术支撑。

技术研发人员：李蒙,张菊,黄骞,刘炜鑫,张绪涛,李才文
受保护的技术使用者：中国科学院海洋研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13