基于HR-MS和NMR的HSCCC溶剂系统筛选方法

本发明涉及天然产物分离纯化，具体涉及基于hr-ms和nmr的hsccc溶剂系统筛选方法。

背景技术：

1、高速逆流色谱(hsccc)是一种新型的液-液分配色谱技术，无固体载体作为固定相，因此不存在液-固色谱中存在的样品死吸附问题，可100％回收样品，优势明显。此外，近年来陆续开发出循环洗脱、中心切割、等度洗脱、梯度洗脱，ph区带等多种洗脱方式，极大的拓宽了hsccc的应用范围，已被广泛应用于黄酮、生物碱、酚酸类、蒽醌类、皂苷、萜类、木脂素、蛋白质、糖类等重要的活性天然产物的分离制备。

2、hsccc分离的关键是需要一个合适的溶剂系统，分配系数k和分离因子α是溶剂系统筛选的两个关键参数。一般来说，k和α应满足：0.2≤k≤5，α≥1.5。目前，hplc技术是最常用的也是最新的溶剂系统筛选技术。但前提是，目标化合物在hplc上可以实现有效的分离。如果两个或更多化合物存在于同一个hplc色谱峰中，hplc技术无法进行分配系数的测定。然而，这种共洗脱的现象在天然产物领域是比较常见的。因此，急需开发出一种针对此类共洗脱化合物分配系数的测定方法来筛选溶剂系统，进行hsccc分离。

技术实现思路

1、基于上述技术问题，本发明的目的是提供基于hr-ms和nmr的hsccc溶剂系统筛选方法。

2、本发明保护基于hr-ms和nmr的hsccc溶剂系统筛选方法，具体包括如下步骤：

3、步骤1，制备样品：取青稞幼苗，切成1cm小段，加入150l 30％乙醇80℃下热回流提取2次，每次2h，合并提取液，减压浓缩至无醇味，上ab-8大孔树脂；先后用去离子水、20％乙醇、30％乙醇、50％乙醇洗脱5bv；取30％乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味，冷冻干燥，得到30％乙醇部位；取30％乙醇部位，注入dac100制备液相色谱，用40％甲醇等度洗脱，得到hsccc待分离样品；

4、步骤2，hplc分析：将步骤1的待分离样品注入hplc分析，色谱条件：platisil odsc18色谱柱(250×4.6mm id,5μm)；流动相：甲醇-水，0-30min，10％-45％乙腈；流速，1.0ml/min；柱温30℃；检测波长，270nm；

5、步骤3，hr-ms分析：将步骤1的待分离样品注入hr-ms分析，质谱条件：sciex的triple tof 6600plos质谱仪，采用turbolonspray离子源，气帘气30psi，离子源载气150psi，离子源载气260psi，离子源温度550℃；ida正离子模式；喷雾电压5500v；cad载气7psi，一级tof ms质量扫描范围50-1500da，诱导碰撞电压10v；二级tof ms质量扫描范围50-1500da，诱导碰撞电压45v，在正离子或负离子模式下提取化合物ms及ms/ms信息，通过massbank database数据库，筛选匹配得分最高的化合物；

6、步骤4，nmr分析：将步骤1的待分离样品用dmso溶解，注入nmr分析，分析条件：采用600mhz核磁共振仪，采集参数：zg30脉冲序列，32k数据点，扫描次数64次，弛豫延迟时间13s，谱图宽度16ppm；提取1h-nmr和cosy谱图，合所述步骤3中化合物结构，筛选1h-nmr的特征信号，作为分配系数测定定量依据；

7、步骤5，溶剂系统筛选：取乙酸乙酯、正丁醇、水，分别按照9：1：10，8：2：10，7：3：10，6：4：10，5：5：10，4：6：10，v/v/v比例配置溶剂系统，分别加入等量的步骤1待分离样品于其中，充分摇晃，待分配平衡后，分别取等体积上下相，减压浓缩至干；将所述浓缩至干的样品用等体积氘代试剂dmso溶解，注入nmr分析，分别提取特征信号1h-nmr的峰面积，记为au和al，分配系数k＝au/al，分离因子α＝k2/k1，k2＞k1。

8、进一步的，所述步骤2中，hplc色谱图中只有1个色谱峰。

9、进一步的，所述步骤3中，通过hr-ms分析，要提取到至少2个化合物的ms及ms/ms信息，并得到相对应化合物结构信息。

10、进一步的，所述步骤4中，每个化合物要筛选到至少1个特征1h-nmr信号。

11、进一步的，所述步骤5中，k和α应满足：0.2≤k≤5，α≥1.5；满足上述条件的溶剂系统可用于hsccc分离，乙酸乙酯-正丁醇-水＝7：3：10，v/v/v的k值和α值符合条件，可用于hsccc分离。

12、本发明还保护上述hsccc溶剂系统的应用，所述的hsccc溶剂系统可用于hsccc分离中，具体过程如下：

13、步骤1，取待分离样品，注入到tbe-300b hsccc中分离，分离条件：溶剂系统，乙酸乙酯-正丁醇-水＝7：3：10，v/v/v，下相为流动相；分离温度，45℃；流速，1.8ml/min；检测波长，270nm；

14、步骤2，将分离得到的化合物用dmso溶解，注入nmr分析，经1h-nmr和13c-nmr鉴定结构，然后比对分离前后的1h-nmr结果。

15、相比于现有的技术，本发明具有如下有益效果：

16、本发明方法基于hr-ms和nmr的hsccc溶剂系统筛选方法，主要针对hplc无法分辨的化合物的溶剂系统的筛选问题，此类化合物无法通过hplc进行分配系数测定。通过本发明方法可以很好分辨分布在同一hplc色谱峰中的化合物，并基于特征1h-nmr信号进行分配系数的测定来筛选溶剂系统。可以有效拓展hsccc的应用范围，属于从无到有的原始创新。

技术特征：

1.基于hr-ms和nmr的hsccc溶剂系统筛选方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于hr-ms和nmr的hsccc溶剂系统筛选方法，其特征在于，所述步骤2中，hplc色谱图中只有1个色谱峰。

3.根据权利要求1所述的基于hr-ms和nmr的hsccc溶剂系统筛选方法，其特征在于，所述步骤3中，通过hr-ms分析，要提取到至少2个化合物的ms及ms/ms信息，并得到相对应化合物结构信息。

4.根据权利要求1所述的基于hr-ms和nmr的hsccc溶剂系统筛选方法，其特征在于，所述步骤4中，每个化合物要筛选到至少1个特征1h-nmr信号。

5.根据权利要求1所述的基于hr-ms和nmr的hsccc溶剂系统筛选方法，其特征在于，所述步骤5中，k和α应满足：0.2≤k≤5，α≥1.5；满足上述条件的溶剂系统可用于hsccc分离，乙酸乙酯-正丁醇-水＝7：3：10，v/v/v的k值和α值符合条件，可用于hsccc分离。

6.一种hsccc溶剂系统的应用，其特征在于，所述的hsccc溶剂系统为权利要求1-5筛选出的hsccc溶剂系统，所述的hsccc溶剂系统可用于hsccc分离中，具体过程如下：

技术总结
本发明公开了基于HR‑MS和NMR的HSCCC溶剂系统筛选方法。具体包括HSCCC待分离样品制备、HPLC分析、HR‑MS分析、NMR分析及溶剂系统筛选。本发明方法主要针对HPLC无法分辨的化合物的溶剂系统的筛选问题，此类化合物无法通过HPLC进行分配系数测定。通过本发明方法可以很好分辨分布在同一HPLC色谱峰中的化合物，并基于特征<supgt;1</supgt;H‑NMR信号进行分配系数的测定来筛选溶剂系统；另外本发明所筛选的HSCCC溶剂系统可用于HSCCC分离中，可以有效拓展HSCCC的应用范围，属于从无到有的原始创新。

技术研发人员：陈涛,李玉林,邹登朗,申诚,王硕
受保护的技术使用者：中国科学院西北高原生物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13