一种丙氨酰谷氨酰胺注射液未知杂质的分离及其结构鉴定方法与流程

本发明属于药物技术分析领域，具体涉及一种丙氨酰谷氨酰胺注射液未知杂质的分离及其结构鉴定方法。

背景技术：

1、丙氨酰谷氨酰胺用于肠外营养，为接受肠外营养的病人提供谷氨酰胺n(2)-l-丙氨酰-l-谷氨酰胺输注后在体内迅速分解为谷氨酰胺和丙氨酸，经检测它的人体半衰期为2.4～3.8分钟(晚期肾功能不全病人为4.2分钟)，血浆清除率为1.6～2.7l/分钟。这一双肽的消失伴随等克分子数的游离氨基酸的增加。它的水解过程可能仅在细胞外发生。当输液量恒定不变时，通过尿液排泄的n(2)-l-丙氨酰-l-谷氨酰胺低于5％，与其它输注的氨基酸相同。

2、丙氨酰谷氨酰胺的合成过程是起始物料l-丙氨酸甲酯化得到l-丙氨酸甲酯，l-丙氨酸甲酯与l-谷氨酰胺脱水得到丙氨酰谷氨酰胺。合成流程图如下：

3、

4、根据丙氨酰谷氨酰胺原料合成工艺，对其工艺中产生的杂质、原料稳定性过程中产生的杂质、制剂生产和稳定性过程中可能产生的杂质进行分析，结合相关指导原则要求，对于已知杂质给出化学结构并分析杂质来源见下表：

5、

6、

7、本品日最大剂量(mdd)为28g，根据ich指南及《化学药物杂质研究的技术指导原则》，杂质三个限度分别为：

8、

9、其中，参比制剂和自研产品中均有一个未知单杂超过0.15％，申请人检测杂质如下表所示。

10、现有方法和文献对其中的有些杂质进行了归属，但仍有该较大杂质属未知杂质。现有技术并未对其进行控制。丙氨酰谷氨酰胺含有未知杂质，将直接影响产品使用的安全性，导致不良反应不可控，为进一步保证药品的质量，对样品中的杂质进行彻底研究，分析其原因，严格限制杂质含量，成为一个亟待解决的技术问题。

11、参比制剂与样品未知杂质检测

12、 样品 未知杂质含量(％) 自研产品 0.19 参比制剂 0.36

技术实现思路

1、本发明的目的提供一种丙氨酰谷氨酰胺注射液中未知杂质的分离及其结构鉴定方法。

2、为了实现本发明目的，采用的技术方案如下：

3、一种丙氨酰谷氨酰胺注射液中未知杂质的分离方法，包括如下步骤：

4、(1)将丙氨酰谷氨酰胺注射液经高温80℃放置24h进行强制降解，得降解溶液；

5、(2)将降解溶液经液相色谱仪分离，检测波长为200nm～210nm，收集该杂质的馏分，得未知杂质溶液；其中流动相为磷酸盐缓冲溶液，取rt6～7min的组分，得未知杂质溶液；

6、优选地，步骤(1)中所述降解溶液中未知杂质的重量含量为2.0～4.0％。

7、优选地，步骤(2)中所述的流动相中还包括辛烷磺酸钠，其浓度为0.05g/l～0.15g/l。

8、优选地，所述步骤(2)中液相色谱仪分离的色谱条件中流速为0.5～1.5ml/min，检测波长为200～210nm，进样体积为100μl，柱温为30～40℃，色谱柱为用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

9、优选地，步骤(2)中未知杂质溶液中的杂质的重量含量≥80％。

10、本发明的再一目的是提供一种丙氨酰谷氨酰胺注射液中未知杂质的结构及其鉴定方法。

11、一种通过上述分离方法得到的丙氨酰谷氨酰胺注射液中未知杂质，通过lc-ms分析，确定其结构式为：

12、

13、进一步地，所述的丙氨酰谷氨酰胺注射液中未知杂质的限度定为不得超过0.3％。

14、本发明还涉及一种丙氨酰谷氨酰胺注射液中未知杂质的结构鉴定方法，采取如下的技术方案：

15、一种丙氨酰谷氨酰胺注射液中未知杂质的结构鉴定方法，包括将所分离得到的杂质溶液通过lc-ms进行分析，所述lc-ms的分析条件中，流动相a为0.1％甲酸溶液，流动相b为乙腈，梯度洗脱条件为：

16、0-2min，90％a→90％a，

17、2-9min，90％a→10％a，

18、9-11min，10％a；

19、11-11.01min，10％a→90％a；

20、11.01-13min，90％a，柱温为28-32℃，紫外检测器波长为215-225nm，柱流量为0.3-1ml/min；所述lc-ms扫描类型：full mass/dd-ms2(topn)；鞘气流速(arb)：35；辅助气体流速(arb)：20；辅助气体加热器温度：350℃；毛细管温度：320℃；分辨率：70000，碰撞能:10，20，40。

21、优选地，所述lc-ms的分析采用电喷雾(esi)正离子检测。

22、本发明首次确认了未知杂质的结构，通过采用高效液相色谱仪根据保留时间确定该杂质是丙氨酰谷氨酰胺降解杂质，由其液相色谱图可以确认。

23、本发明通过lc-ms确定该未知杂质的分子量：由lc-ms图谱得到准确分子离子峰m/z；则该未知杂质分子量为：200.1030,根据降解途径推断其分子式为：c8h13n3o3。

24、分析产生原因：丙氨酰谷氨酰胺中羧基与胺基脱水形成该未知杂质，产生路线如下：

25、

26、制定丙氨酰谷氨酰胺注射液中该未知杂质的限度：不得超过0.3％。

27、结合丙氨酰谷氨酰胺注射液参比制剂检出量为0.36％，故将此未知杂质在自研产品中的限度定不超过0.3％，以确保自研产品质量不低于参比制剂。

28、本发明采用十八烷基键合硅胶柱进行分离，用液相色谱仪实现未知杂质的分离及富集，并用lc-ms进一步确认该未知杂质的化学结构，并分析产生原因，方法简单，可用于丙氨酰谷氨酰胺注射液的杂质分析控制，确保质量及用药安全。

1.一种丙氨酰谷氨酰胺注射液中未知杂质的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种丙氨酰谷氨酰胺注射液中未知杂质的分离方法，其特征在于，步骤(1)中降解溶液中未知杂质的重量含量为2.0～4.0％。

3.根据权利要求1所述的一种丙氨酰谷氨酰胺注射液中未知杂质的分离方法，其特征在于，所述的流动相中还包括辛烷磺酸钠，其浓度为0.05g/l～0.15g/l。

4.根据权利要求1所述的一种丙氨酰谷氨酰胺注射液中未知杂质的分离方法，其特征在于，所述步骤(2)中液相色谱仪分离的色谱条件中流速为0.5～1.5ml/min，检测波长为200～210nm，进样体积为100μl，柱温为30～40℃，色谱柱为用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

5.根据权利要求1所述的一种丙氨酰谷氨酰胺注射液中未知杂质的分离方法，其特征在于，所述步骤(2)中未知杂质溶液中的杂质的重量含量≥80％。

6.一种如权利要求1至5任意所述分离方法得到的丙氨酰谷氨酰胺注射液中未知杂质，通过lc-ms分析，确定其结构式为：

7.如权利要求6所述的丙氨酰谷氨酰胺注射液中未知杂质的限度定为不得超过0.3％。

8.一种如权利要求丙氨酰谷氨酰胺注射液中未知杂质的结构鉴定方法，其特征在于，包括将所分离得到的杂质溶液通过lc-ms进行分析，所述lc-ms的分析条件中，流动相a为0.1％甲酸溶液，流动相b为乙腈，梯度洗脱条件为：0-2min，90％a→90％a；