一种流式平台外周血标本检测技术方法与流程

本发明涉及标本检测，具体为一种流式平台外周血标本检测技术方法。

背景技术：

1、检验科作为临床科室的眼睛，不仅将医院、医师、护士的需求反馈给高校、科研机构和ivd企业，还可以将高校、科研机构、ivd企业的相关技术、方法和原理转化为临床医学检验技术，将基础研究内容和成果应用于检验，服务于临床。

2、在基础研究中已经有大量关于癌细胞信号传导通路蛋白和关键酶表达水平的研究，并且纯化了一些靶向治疗药物用于调节这些通路蛋白和关键酶的表达，从而实现抑制体外培养环境中和动物体内癌细胞的转移、侵袭和迁徙能力，目前，我们需要便捷快速的平台和方法将其应用于临床标本的检测，进而实现将这些基础研究成果向临床应用的转化。

3、met-flow检测技术自2020年出现以来，到目前为止其应用仅限于基础研究领域，国内尚无相关文献报道，有文献报道国外实验室对体外培养的细胞进行过该技术的检测，但是研究平台高端，技术难度大，而且患者体内的免疫细胞不同于体外环境中培养的细胞，很难在临床推广，本技术的发明实现了将met-flow技术在临床领域的应用，技术平台经典，操作便捷，出报告时间快速，结果精准，尤其是技术实现过程中条件的摸索，抗体浓度的选择，荧光种类的选择都是本发明的创新点，实现了该技术从免疫学角度为临床疾病的诊断，分级分期，治疗，预后判断，生存时间等提供了技术支持，更是实现了将已经成熟的基础研究成果在临床患者进行验证，为疾病特别是癌症的靶向治疗提供了更多思路。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种流式平台外周血标本检测技术方法，具备为临床疾病的鉴别诊断，分级分期，预后判断，靶向治疗等提供新思路等优点，解决了对体外培养的细胞进行过该技术的检测，但是研究平台高端，技术难度大，而且患者体内的免疫细胞不同于体外环境中培养的细胞，很难在临床推广的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种流式平台外周血标本检测技术方法，包括以下步骤，

3、1)首先取外周静脉血后用edta抗凝，再加入平衡盐溶液并混均；

4、2)将分层液加入至试管中，用吸管沿管壁缓缓将血加入至分层液面上，再置入水平离心机中进行离心；

5、3)用尖吸管吸取截面的细胞层，至于另一试管中，加入适量的平衡盐溶液，混均后进行离心来分离出单个核细胞；

6、4)然后利用高剪切均质机对新鲜外周血单个核细胞进行met flow检测；

7、5)将带荧光素的抗体导入至细胞的内部；

8、6)对细胞表面抗原以及细胞内部的代谢关键酶以及蛋白表达水平进行检测。

9、进一步，所述步骤2)中水平离心机的工作时间为10-12min且每分钟1400-1600r/min，可见绝大多数单个核细胞悬浮于血浆和分层液的界面，且呈白膜状。

10、进一步，所述步骤3)中离心机的离心时间为8-10min，且每分钟800-1000r/min，来弃除上清。

11、进一步，所述步骤6)中细胞表面的抗原包括cd3、cd4、cd8、cd45、cd16、cd56、cd19和hla-dr中的任意一种或多种。

12、进一步，所述步骤6)中细胞内部代谢关键酶和蛋白包括但不限于：acac、idh、g6pd、ass1、hk1、cpt1a、glut1、prdx2、atp5a。

13、进一步，所述步骤4)中高剪切均质机的运作时间为14-16min，且转速为2600-2800r/min。

14、进一步，由于运用于临床患者外周血标本的检测，每个患者都有其特异性，根据患者血常规结果，确定各抗体用量，计算各抗体的体系浓度，根据要检测的靶蛋白种类，设计荧光剂的类型搭配。

15、进一步，所述抗体体系浓度的检测，首先基于spr技术,利用protein a与抗体fc端特异性结合的特点,通过测定一系列浓度梯度的单克隆抗体对照品与protein a结合的响应单位,建立标准曲线。

16、进一步，通过读取未知浓度抗体与protein a芯片结合的响应值,实现对未知抗体浓度的定量，并对该方法的准确度、重复性、专属性、线性范围及耐用性等参数进行考察。

17、与现有技术相比，本申请的技术方案具备以下有益效果：

18、该流式平台外周血标本检测技术方法，该技术在临床的成熟应用能够将大量基础研究中涉及的代谢蛋白和关键酶的检测应用于临床标本检测，为临床疾病的鉴别诊断，分级分期，预后判断，靶向治疗等提供新思路，基于流式平台，metflow检测技术方法的建立，成功运用固定破膜技术将带荧光素的抗体导入单个细胞内部，根据要检测的靶蛋白种类，设计荧光剂的类型搭配，让实验既简单便捷，又精准严谨，因为运用于临床患者外周血标本的检测，每个患者都有其特异性，根据患者血常规结果，确定各抗体用量，计算各抗体的体系浓度。

技术特征：

1.一种流式平台外周血标本检测技术方法，其特征在于，包括以下步骤，

2.根据权利要求1所述的一种流式平台外周血标本检测技术方法，其特征在于：所述步骤2)中水平离心机的工作时间为10-12min且每分钟1400-1600r/min，可见绝大多数单个核细胞悬浮于血浆和分层液的界面，且呈白膜状。

3.根据权利要求1所述的一种流式平台外周血标本检测技术方法，其特征在于：所述步骤3)中离心机的离心时间为8-10min，且每分钟800-1000r/min，来弃除上清。

4.根据权利要求1所述的一种流式平台外周血标本检测技术方法，其特征在于：所述步骤6)中细胞表面的抗原包括cd3、cd4、cd8、cd45、cd16、cd56、cd19和hla-dr中的任意一种或多种。

5.根据权利要求1所述的一种流式平台外周血标本检测技术方法，其特征在于：所述步骤6)中细胞内部代谢关键酶和蛋白包括但不限于：acac、idh、g6pd、ass1、hk1、cpt1a、glut1、prdx2、atp5a。

6.根据权利要求1所述的一种流式平台外周血标本检测技术方法，其特征在于：所述步骤4)中高剪切均质机的运作时间为14-16min，且转速为2600-2800r/min。

7.根据权利要求1所述的一种流式平台外周血标本检测技术方法，其特征在于：由于运用于临床患者外周血标本的检测，每个患者都有其特异性，根据患者血常规结果，确定各抗体用量，计算各抗体的体系浓度，所述根据要检测的靶蛋白种类，设计荧光剂的类型搭配。

8.根据权利要求7所述的一种流式平台外周血标本检测技术方法，其特征在于：所述抗体体系浓度的检测，首先基于spr技术,利用protein a与抗体fc端特异性结合的特点,通过测定一系列浓度梯度的单克隆抗体对照品与protein a结合的响应单位,建立标准曲线。

9.根据权利要求8所述的一种流式平台外周血标本检测技术方法，其特征在于：通过读取未知浓度抗体与protein a芯片结合的响应值,实现对未知抗体浓度的定量，并对该方法的准确度、重复性、专属性、线性范围及耐用性等参数进行考察。

技术总结
本发明涉及一种流式平台外周血标本检测技术方法，包括以下步骤，1)首先取外周静脉血后用EDTA抗凝，再加入平衡盐溶液并混均；2)将分层液加入至试管中，用吸管沿管壁缓缓将血加入至分层液面上，再置入水平离心机中进行离心；3)用尖吸管吸取截面的细胞层，至于另一试管中，加入适量的平衡盐溶液，混均后进行离心来分离出单个核细胞；4)然后利用高剪切均质机对新鲜外周血单个核细胞进行Met flow检测；5)将带荧光素的抗体导入至细胞的内部。该流式平台外周血标本检测技术方法，该技术在临床的成熟应用能够将大量基础研究中涉及的代谢蛋白和关键酶的检测应用于临床标本检测，为临床疾病的鉴别诊断，分级分期，预后判断，靶向治疗等提供新思路。

技术研发人员：许宏敏,刘婕,田亚琼,王耀,隋强君
受保护的技术使用者：天津市第三中心医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13