一种简单快速检测MTC和/或OTC和/或TC的方法

本发明属于抗生素检测，涉及多种四环素类抗生素的检测，具体涉及在弱酸条件下基于阳离子表面活性剂pei和金属离子mg2+协同荧光增敏检测多种四环素类抗生素的方法。

背景技术：

1、四环素类抗生素(tetracyclines，tcs)是一类由放线菌产生的具有并四苯结构的广谱抗生素药物，包括金霉素(chlortetracycline，ctc)、土霉素(oxytetracyline，otc)、四环素(tetracyline，tc)及半合成衍生物美他环素(metacycline，mtc)等。tcs因抗菌性能良好、成本低廉、副作用小，被广泛地应用于医疗和养殖等行业。近些年来，由于其广泛应用，导致土壤、水以及奶制品等食品中大量积累四环素类抗生素，也对人体健康引起了严重的副作用，如，削弱人体的免疫系统、过敏或中毒反应、抑制骨骼生长、引起抗生素耐药性等危害。基于此，许多国家和监管组织制定了法规来控制动物食品中抗生素的用量或者禁止使用，严格设定了tcs在动物食品源中的最大残留限量(maximum residue limits，mrls)。我国的最新国标gb31650-2019《食品安全国家标准》规定了tcs的mrls，在家畜家禽的肌肉、肝和肾中的mrls分别为200μg/kg、600μg/kg和1200μg/kg；中国以及欧盟规定牛奶中的mrls为100μg/l(约0.2μmol/l)，因此高灵敏检测tcs对食品安全和公众健康具有重要意义。

2、目前，常见的四环素类抗生素的检测方法主要有高效液相色谱法(highperformance liquid chromatography，hplc)、液相色谱-质谱联用法(liquidchromatograph mass spectrometer，lc-ms)、薄层分析分析法(thin layerchromatography，tlc)、酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)等。这些传统的检测方法虽然已能实现对tcs的精准检测，且选择性强、假阳性低，但样品前处理操作复杂、需要训练有素的操作人员，且耗时长，不利于现场进行检测。因此，建立一种在食品以及环境中快速、简单、有效检测四环素类抗生素是十分必要的。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种简单快速检测多种四环素类抗生素的检测方法，在弱酸条件下基于阳离子表面活性剂pei和金属离子mg2+协同荧光增敏检测多种四环素类抗生素。

2、为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

3、一种简单快速检测mtc和/或otc和/或tc的方法，包括以下步骤：在酸性缓冲溶液中加入表面活性剂pei、mg2+及待测溶液形成待测体系，采用荧光光度分析仪检测待测体系的荧光强度，在525nm处的荧光强度有增强，则待测溶液中含有mtc、otc、tc中的一种或多种。

4、在弱酸性条件下弱荧光且以两性离子形态(tcsh2±)的tcs，被富有氨基的阳离子表面活性剂pei发生去质子化，形成双阴离子形态(tcs2-)，使其荧光增敏。同时，tcs的酮基和羟基分子内的氧发生螯合作用与mg2+配位形成稳定的六元络合物，加入的pei与此络合物会形成更稳定的体系，使其荧光强度会大大增强。

5、进一步的，酸性缓冲溶液为ph为6～7的醋酸缓冲溶液，醋酸缓冲溶液的浓度为20mmol/l。

6、作为优选，酸性缓冲溶液为ph为6的醋酸缓冲溶液，醋酸缓冲溶液的浓度为20mmol/l。

7、进一步的，待测体系中的pei浓度为0.4％，mg2+浓度为10mmol/l。

8、一种定量检测mtc或otc或tc的方法，包括以下步骤：

9、1)在酸性缓冲溶液中加入表面活性剂pei、mg2+及不同标准浓度的mtc或otc或tc，以mtc或otc或tc浓度为横坐标，以相对荧光值为纵坐标作标准曲线，计算回归方程及相关系数；

10、2)在酸性缓冲溶液中加入表面活性剂pei、mg2+及待测溶液形成待测体系，采用荧光光度分析仪检测待测体系在525nm处的荧光强度，将测得的相对荧光值代入回归方程中，得到待测溶液中的mtc或otc或tc浓度。

11、进一步的，相对荧光值为激发波长370nm时发射波长525nm处的所测mtc或otc或tc的荧光值与无mtc或otc或tc时的荧光值差。

12、进一步的，mtc的线性回归方程为y＝5.3079x+0.0836；otc的线性回归方程为y＝9.9725x+0.1567；tc的线性回归方程为y＝15.277x-0.0161。

13、采用本发明方法mtc的检出限为3.6nmol/l；otc的检出限为4.8nmol/l；tc的检出限为2.7nmol/l。

14、相比于现有技术，本发明的有益效果为：

15、(1)本发明基于pei和mg2+两者对tcs的荧光具有显著的协同增敏作用检测牛奶中tcs，适用于弱酸性环境中残留tcs的分析，克服了tcs的弱荧光的特点，简单快速、成本低、耗时短、灵敏度高、特异性好。

16、(2)本发明对牛奶中tcs的检测中具有良好的加标回收率，检测结果可靠。

17、(3)本发明方法可以检测多种tcs，并对所检测出的tcs进行定量分析。

技术特征：

1.一种简单快速检测mtc和/或otc和/或tc的方法，其特征在于，包括以下步骤：在酸性缓冲溶液中加入表面活性剂pei、金属离子mg2+及待测溶液形成待测体系，采用荧光光度分析仪检测待测体系的荧光强度，在525nm处的荧光强度有增强，则待测溶液中含有mtc、otc、tc中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的简单快速检测mtc和/或otc和/或tc的方法，，其特征在于，酸性缓冲溶液为ph为6～7的醋酸缓冲溶液，醋酸缓冲溶液的浓度为20mmol/l。

3.根据权利要求2所述的简单快速检测mtc和/或otc和/或tc的方法，，其特征在于，酸性缓冲溶液为ph为6的醋酸缓冲溶液，醋酸缓冲溶液的浓度为20mmol/l。

4.根据权利要求1所述的简单快速检测mtc和/或otc和/或tc的方法，，其特征在于，待测体系中的pei浓度为0.4％，mg2+浓度为10mmol/l。

5.一种定量检测mtc或otc或tc的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的定量检测mtc或otc或tc的方法，其特征在于，相对荧光值为激发波长370nm时发射波长525nm处的所测mtc或otc或tc的荧光值与无mtc或otc或tc时的荧光值差。

7.根据权利要求5所述的定量检测mtc或otc或tc的方法，其特征在于，在5～00nmol/l的浓度范围内，mtc的线性方程为y＝5.3079x+0.0836，检出限为3.6nmol/l。

8.根据权利要求5所述的定量检测mtc或otc或tc的方法，其特征在于，在10～2000nmol/l的浓度范围内，otc的线性方程为y＝9.9725x+0.1567，检出限为4.8nmol/l。

9.根据权利要求5所述的定量检测mtc或otc或tc的方法，其特征在于，在5～200nmol/l的浓度范围内，tc的线性方程为y＝15.277x-0.0161，检出限为2.7nmol/l。

技术总结
本发明公开了一种简单快速检测MTC和/或OTC和/或TC的方法，属于抗生素检测技术领域。该方法在酸性缓冲溶液中加入表面活性剂PEI、金属离子Mg<supgt;2+</supgt;及待测溶液形成待测体系，采用荧光光度分析仪检测待测体系的荧光强度，在525nm处的荧光强度有增强，则待测溶液中含有四环素类抗生素；其中，四环素类抗生素为MTC、OTC、TC中的一种或多种。本发明基于PEI和Mg<supgt;2+</supgt;两者对四环素类抗生素的荧光具有显著的协同增敏作用检测牛奶中TCs，适用于弱酸性环境中残留TCs的分析，克服了TCs的弱荧光的特点，简单快速、成本低、耗时短、灵敏度高、特异性好。

技术研发人员：李胎花,王安琪,王雪,钱美汝,杨瑾,韩建刚,金龙
受保护的技术使用者：南京林业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12