一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法

本申请涉及生物样品检测领域，尤其涉及一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法。

背景技术：

1、皮质醇是一种类固醇激素，在糖代谢、维持血管张力、免疫调节以及压力应激方面起着关键作用，主要受下丘脑-垂体的反馈调节。尿游离皮质醇(ufc)是各类肾上腺皮质功能障碍的敏感指标，尤其是皮质醇增多症(库欣综合征)的敏感指标，同时24小时ufc的测定被指南推荐为库欣综合征筛查的一线测试。

2、ufc的传统检测方法有放射免疫法、发光免疫法、液相色谱-紫外检测法，气相色谱-质谱法，这些方法均存在前处理过程复杂且步骤繁琐的缺点，其中临床常用的放射免疫法和发光免疫法还存在易发生交叉反应，且检测灵敏度有限的问题。近年来，液相色谱串联质谱法(liquid chromatography tandem mass spectrometry,lc-ms/ms)越来越多的被用于ufc的检测，该方法具有灵敏度高、特异性好、通量高和耗时短的优点。在液相色谱串联质谱法中，为了除去样品蛋白的干扰，检测前通常需要对样本进行前处理，目前所报道的针对样本前处理方法多为蛋白沉淀法、液液萃取(liquid-liquid extraction，lle)或固相萃取法(solid phase extraction，spe)，而目前这些前处理方法不仅操作步骤繁琐、样本用量大、而且耗时长、试剂耗材成本高且存在环境污染，此外用于绘制标准曲线的定标品溶液多采用4％(w/w)的牛血清白蛋白溶液或纯溶液，与真实人样基质存在较大差别，从而无法准确反映待测样品的实际情况，导致该方法难以规模化的应用于尿游离皮质醇的检测，因此如何提供一种规模化的利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法，是目前亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、本申请提供了一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法，以解决现有技术中液相色谱串联质谱法难以被大规模应用于尿游离皮质醇检测的技术问题。

2、第一方面，本申请提供了一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法，所述方法包括：

3、将定标品溶液和待测尿液样本分别与皮质醇同位素内标工作溶液进行混合，后进行离心，取上清液，分别得到定标品上清液和待测样本上清液；

4、采用液相色谱串联质谱对所述所取定标品上清液直接进行检测，并绘制标准曲线；

5、采用液相色谱串联质谱对所述待测样本上清液进行检测，并根据所述标准曲线，得到待测尿液样本游离皮质醇的含量；

6、其中，所述皮质醇同位素内标工作溶液包皮质醇同位素内标溶质和皮质醇同位素内标溶剂；

7、所述皮质醇同位素内标溶质包括皮质醇-d和/或皮质醇-13c；

8、所述皮质醇同位素内标溶剂包括甲醇和/或水。

9、可选的，所述方法还包括：

10、对离体的尿液样本进行固相萃取至不含皮质醇为止，得到空白尿基质；

11、配制皮质醇的母液，并进行第一稀释，后以空白尿基质进行第二稀释，得到定标品溶液；

12、其中，所述定标品溶液的浓度为0.625ng/ml～500ng/ml。

13、可选的，所述第一稀释的稀释溶剂为甲醇和水的混合物，其中，所述甲醇和所述水的体积之比为1:3～3:1。

14、可选的，所述第二稀释包括以逐级稀释的方式进行第二稀释，所述第二稀释的终点溶液浓度为0.625ng/ml～500ng/ml。

15、可选的，所述待测尿液样本的体积和所述皮质醇同位素内标工作溶液的体积之比为1:2～1:6。

16、可选的，所述皮质醇同位素内标溶剂包括甲醇和水的混合物，其中，所述甲醇和所述水的体积之比为1:3～3:1。

17、可选的，所述待测尿液样本的取样量为10μl～100μl。

18、可选的，所述离心的转速≥12000rpm，所述离心的时间为2min～10min。

19、可选的，所述液相色谱串联质谱包括液相色谱，所述液相色谱的色谱柱为反相色谱柱，所述液相色谱的柱温为30℃～50℃，所述液相色谱的进样量为2μl～10μl，所述液相色谱的流速为0.3ml/min～0.5ml/min；所述液相色谱采用梯度洗脱方式进行色谱分离，所述梯度洗脱的流动相a包括质量分数为0％～0.1％甲酸的水溶液，所述梯度洗脱的流动相b包括质量分数为0％～0.1％甲酸的甲醇溶液。

20、可选的，所述液相色谱串联质谱包括质谱；

21、所述质谱包括电喷雾离子源，所述质谱的工作模式为负离子模式，所述质谱的离子源参数包括气帘气：30psi±5psi，碰撞气：9.0psi±0.2psi，离子源电压：-4500v±10v，离子源温度：500℃±10℃，雾化气：40psi±5psi，辅助加热气：50psi±5psi。本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：

22、本申请实施例提供的一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法，区别于传统的液相色谱串联质谱检测皮质醇，本方法仅仅在待测尿液样本中加入皮质醇同位素内标工作溶液，混匀后进行离心，得到上清液再通过液相色谱实现分离并通过质谱进行检测，其中同位素内标溶液含有一定比例的有机溶剂，可对尿液中少量蛋白进行沉淀，实现了无需现有技术中的固相萃取(spe)；而同位素内标溶液含有一定比例的水可使待测上清液更接近色谱流动相的组成和极性，有利于降低背景化学噪音的影响，提高信噪比。由于该方法简化了样品的前处理，使得对样本的前处理简单、快速、样本用量少且试剂耗材成本低，并且待测样本和同位素内标工作液混合离心即可上机检测的前处理操作有利于实现规模化的液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇，因此通过采用该方法能实现规模化的液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇。

技术特征：

1.一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法，其特征在于，所述方法包括：将定标品溶液和待测尿液样本分别与皮质醇同位素内标工作溶液进行混合，后进行离心，取上清液，分别得到定标品上清液和待测样本上清液；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一稀释的稀释溶剂为甲醇和水的混合物，其中，所述甲醇和所述水的体积之比为1:3～3:1。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二稀释包括以逐级稀释的方式进行第二稀释，所述第二稀释的终点溶液浓度为0.625ng/ml～500ng/ml。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测尿液样本的体积和所述皮质醇同位素内标工作溶液的体积之比为1:2～1:6。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述皮质醇同位素内标溶剂包括甲醇和水的混合物，其中，所述甲醇和所述水的体积之比为1:3～3:1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测尿液样本的取样量为10μl～100μl。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心的转速≥12000rpm，所述离心的时间为2min～10min。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱包括液相色谱，所述液相色谱的色谱柱为反相色谱柱，所述液相色谱的柱温为30℃～50℃，所述液相色谱的进样量为2μl～10μl，所述液相色谱的流速为0.3ml/min～0.5ml/min。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱包括质谱；

技术总结
本申请涉及生物样品检测领域，尤其涉及一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法；包括：将定标品溶液和待测尿液样本分别与皮质醇同位素内标工作溶液进行混合，后进行离心，取上清液，分别得到定标品上清液和待测样本上清液；采用液相色谱串联质谱对定标品上清液进行检测，并绘制标准曲线；采用液相色谱串联质谱对待测样本上清液进行检测，并根据所述标准曲线得到待测尿液样本游离皮质醇的含量；其中，皮质醇同位素内标工作溶液的溶质包括皮质醇‑d和/或皮质醇‑13C；本发明前处理简单、样本用量小、试剂耗材成本低，有利于实现规模化的液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇。

技术研发人员：沈莹,程黎明
受保护的技术使用者：华中科技大学同济医学院附属同济医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12