一种注射用比伐芦定有关物质的HPLC测定方法与流程

本发明涉及一种注射用比伐芦定有关物质的hplc测定方法，属肽化合物测定。

背景技术：

1、比伐芦定(bivalirudin)，伐卢定是一种人工合成的新型抗凝血药物，为凝血酶直接的、特异的、可逆性的抑制剂。最初由瑞士巴吉(biogen)公司研发成功，后转让给美国medicinescompany，于2000年批准在美国上市。它的抗凝成分是一种水蛭素衍生的20肽化合物。无论是处于血液循环中的凝血酶，还是与血栓结合的chemicalbook凝血酶，比伐卢定均可与其催化位点和阴离子结合位点发生特异性结合，从而直接抑制凝血酶的活性，而其作用特点是短暂、可逆的。早期的临床研究显示：比伐卢定抗凝治疗效果确切，且出血事件的发生率较低，和传统的肝素抗凝治疗相比使用更为安全。主要用于预防血管成型介入治疗不稳定性心绞痛前后的缺血性并发症。

2、注射用比伐芦定有关物质测定中，常见的杂质结构式如下：

3、

4、目前，未有注射用比伐芦定有关物质hplc检测方法的报道及文献资料。

5、因此，开发一种简单可行，能将比伐芦定及其存在的几种杂质依次洗脱且分离，并做定量分析的方法势在必行且具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种测定注射用比伐芦定有关物质的hplc测定方法。该方法利用梯度洗脱的高效液相色谱法，实现了有效的洗脱、分离和定量注射用比伐芦定中的有关物质，使有关物质与主峰完全分离，分析速度快，检测效果好。

2、为达到上述目的，本发明采取以下技术方案：

3、一种注射用比伐芦定有关物质的hplc测定方法，所述的比伐芦定有关物质的化学结构式如下：

4、

5、所述hplc测定方法的步骤是：

6、(1)待测样品溶液的制备

7、i溶液制备：将注射用比伐芦定用水配制成浓度2mg/ml的溶液，通过色谱分析，得到图谱并进行分析，通过对样品溶液进行分析得到样品中比伐芦定的峰面积；

8、ii溶液制备：取溶液i用水稀释成浓度为20μg/ml的对照溶液；

9、(2)样品检测

10、采用c18色谱柱，流动相由流动相a和流动相b组成，其中，所述流动相a为醋酸铵缓冲液和水的混合溶液，其中水的体积分数为30％～70％；所述流动相a中醋酸铵缓冲液的浓度为0.01mol/l～0.2mol/l，用冰醋酸调ph为3.0～7.0；所述流动相b为醋酸铵缓冲液和乙腈的混合溶液，其中乙腈的体积分数为30％～70％。

11、梯度洗脱时间与流动相比例如下：

12、

13、

14、流速为0.7～1.5ml/min，检测波长为205nm～254nm，柱温为30℃～60℃，取步骤(1)制备好的待测样品溶液i、ii分别注入hplc，检测后得到图谱并进行分析，通过自身对照法得到样品中比伐芦定有关物质的含量。

15、本发明的优选技术方案如下：

16、1、本发明采用的检测波长为205nm～254nm，其中检测波长为226nm时，紫外吸收强度适中，故检测波长优先选择226nm。

17、2、本发明采用的缓冲盐溶液用冰醋酸调ph范围3.0～7.0，使用ph值为5.8时，分离度最高，故选择ph为5.8。

18、3、本发明的方法的流动相a中，水的体积分数为50％。

19、4、本发明的方法的流动相b中，乙腈的体积分数是30％～70％，选择乙腈的体积分数为40％，原因在于保证达到基线分离的前提下，使用乙腈体积分数40％的流动相进行样品测试可以使分析时间最短，提高分析效率。

20、5、进一步，步骤(2)所述醋酸铵缓冲液的浓度为0.05mol/l。

21、6、进一步，步骤(2)所述流动相的流速为1ml/min。

22、7、进一步，步骤(2)所述的柱温为30℃。

23、8、本发明最优的技术方案是：

24、hplc仪：赛默飞u3000；

25、色谱柱：vydac c18，4.6×250mm，5μm；

26、流动相：以0.05mol/l醋酸铵缓冲液(取醋酸铵3.9g，加水1000ml使溶解，用冰醋酸调节ph值至5.8)-水(1:1)为流动相a，0.05mol/l醋酸钠缓冲液-乙腈(1:1)为流动相b；

27、检测波长：226nm；

28、流速：1ml/min；

29、柱温：30℃。

30、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

31、本发明方法能够有效的分析注射用比伐芦定：它以醋酸铵缓冲液-乙腈作为流动相，在适当的紫外检测波长和流速下，通过主成分自身对照法测定注射用比伐芦定的有关物质。该方法能够使有关物质很好的达到基线分离，能够准确测定比伐芦定有关物质的含量。该方法简单、快速、准确、高效，重现性好，为注射用比伐芦定质量标准的制定建立了良好的基础。

技术特征：

1.一种注射用比伐芦定有关物质的hplc测定方法，其特征在于：所述的比伐芦定有关物质的化学结构式如下：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的醋酸铵缓冲液的浓度为0.05mol/l。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的流动相a用冰醋酸调ph为5.8。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的流动相a中水的体积分数为50％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的流动相b中乙腈的体积分数为40％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的流动相梯度洗脱时间与流动相比例如下：

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的流动相的流速为1.0ml/min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的检测波长为226nm。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的柱温为30℃。

技术总结
本发明公开一种注射用比伐芦定有关物质的HPLC测定方法，属肽化合物测定技术领域。该方法以醋酸钠缓冲液‑乙腈作为流动相，在适当的紫外检测波长和流速下，通过主成分自身对照法测定注射用比伐芦定的有关物质。该方法能够使有关物质很好的达到基线分离，能够准确测定注射用比伐芦定有关物质的含量。该方法简单、快速、准确、高效，重现性好，为注射用比伐芦定质量标准的制定建立了良好的基础。

技术研发人员：陈帅,董珍珠,柳铎芳
受保护的技术使用者：江苏诺泰澳赛诺生物制药股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12