一种咔喏霉素中有关物质的检测方法与流程

本发明属于药物杂质的药物分析检测领域，具体涉及咔喏霉素中有关物质的分析检测方法。

背景技术：

1、咔喏霉素(kanamycin)，其分子式为c73h103n17o26，[m-1]的分子式为c73h102n17o26，其精确分子质量为1632.7182。质荷比m/z＝1632.7182(实际值1632.7202)[m-2]的分子式为c73h101n17o26，其精确分子质量为1631.7104，质荷比m/z＝815.8552(实际值815.8565)。咔喏霉素是首次通过全化学合成方式获得的类似于达托霉素的环脂肽类化合物。由于环脂肽类化合物空间构象复杂，存在多个手性中心，无论是手性全合成还是手性拆分，都具有极大的合成难度，由于合成步骤长，合成过程中副产物较多，如何实现主药和杂质的结构全解析，并进行有效的质量控制，都将面临巨大挑战。目前现有技术中未见关于咔喏霉素有关杂质的研究和报道，急需开发一种有效分离各杂质的检测方法，以实现对其进行有效的质量控制。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种咔喏霉素原料药及其制剂中有关物质的检测方法，采用的技术方案如下：

2、一种使用高效液相色谱法对咔喏霉素中有关物质进行检测，其色谱条件为：

3、采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂5μm*4.6*250mm的色谱柱；以ph 4.5-4.7的磷酸二氢铵溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱；所述咔喏霉素主峰的保留时间在38～41分钟之间。

4、所述检测方法，按下表1进行梯度洗脱：

5、表1：

6、

7、

8、所述梯度洗脱顺序优选为：

9、表2：

10、

11、本发明所述一种咔喏霉素中有关物质的检测方法，所述色谱条件还包括：进样量为15-25μl；流速为0.8-1.2ml/min，优选为0.9-1.1ml/min；检测时间为95min；柱温为25-30℃；检测波长为220-225nm。

12、本发明所述一种咔喏霉素中有关物质的检测方法，步骤如下：

13、(1)色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂5μm*4.6*250mm的色谱柱；以ph 4.5-4.7的磷酸二氢铵溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱；进样量为15-25μl；流速为0.8-1.2ml/min，优选为0.9-1.1ml/min；检测时间为95min，后运行15min；柱温为25-30℃；检测波长为220-225nm；所述咔喏霉素主峰的保留时间在38～41分钟之间，按下表3进行梯度洗脱：

14、表3：

15、

16、

17、(2)流动相溶液制备：以ph 4.5-4.7的磷酸二氢铵溶液为流动相a，以乙腈为流动相b；

18、(3)空白溶液制备：以步骤(1)中初始流动相溶液为空白溶液，即流动相a和流动相b以体积比为64-66:34-36的混合溶液；

19、(4)供试品溶液制备：取咔喏霉素适量，加步骤(3)中空白溶液作为溶剂溶解并稀释制成每1ml含0.9-1.1mg咔喏霉素的溶液，作为供试品溶液；

20、(5)精密量取空白溶液、供试品溶液适量，注入液相色谱仪，记录色谱图。

21、优选地，所述色谱柱为welch ultimatexb-c18色谱柱(5μm，4.6*250mm)或其他等效色谱柱。

22、优选地，所述色谱条件中，进样量为20μl；流速为1.0ml/min；柱温为30℃，检测波长为220nm，以ph4.6的磷酸二氢铵溶液为流动相a。

23、本发明所述检测方法，可用于检测咔喏霉素原料药、咔喏霉素制剂中咔喏霉素及有关物质。

24、发明人在研究过程中，对不同检测仪器进行了考察：

25、采用agilent1100、agilent1260和waters e2695-2498、waters e2695-2998四台仪器对批次为21111911注射用咔喏霉素进行有关物质分析，考察不同厂家不同型号的仪器对有关物质分析结果的影响。

26、色谱条件：采用色谱柱welch ultimate xb-c18色谱柱(5μm，4.6*250mm)；以ph4.60的磷酸二氢铵(取磷酸二氢铵2.25g，加水溶解并稀释至1000ml)为流动相a，以乙腈为流动相b，按表4进行梯度洗脱；进样量为20μl；流速为1.0ml/min；时间为95min；柱温为30℃；检测波长为220nm。

27、表4梯度洗脱表

28、

29、

30、空白溶液：初始比例的流动相溶液。

31、供试品溶液：取注射用咔喏霉素(批号：21111911)适量，加空白溶液稀释制成每1ml中约含1.0mg的溶液。

32、试验结果

33、精密量取供试品溶液适量，注入液相色谱仪，记录色谱图。采用不同高效液相色谱仪的注射用咔喏霉素液相色谱图见附图1-4。

34、表5不同仪器有关物质分析结果表

35、

36、试验结论：通过采用上述不同高效液相色谱仪的实验结果可知，相同的色谱条件，不同仪器之间咔喏霉素主峰保留时间34.555min～44.023min之间，有一定的偏差；杂质峰个数在13～17之间。咔喏霉素主峰保留时间在38～41min时，主峰前后杂质峰的分离效果最好。

37、本发明的有益效果：本发明方法解决了一种咔喏霉素原料药及制剂中杂质难以分离表征的问题，可表征其杂质，并将杂质进行面积归一化定量，可有效保证咔喏霉素及其相关产品质量。

技术特征：

1.一种咔喏霉素中有关物质的检测方法，其特征在于，使用高效液相色谱法对咔喏霉素中有关物质进行检测，其色谱条件为：

2.根据权利要求1所述的一种咔喏霉素中有关物质的检测方法，其特征在于，按下表进行梯度洗脱：

3.根据权利要求1所述的一种咔喏霉素中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：进样量为15-25μl；流速为0.8-1.2ml/min；检测时间为95min；柱温为25-30℃；检测波长为220-225nm。

4.根据权利要求1-3任一所述的一种咔喏霉素中有关物质的检测方法，其特征在于，所述检测方法步骤如下：

5.根据权利要求1-3任一所述的一种咔喏霉素中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为welch ultimatexb-c18色谱柱(5μm，4.6*250mm)或其他等效色谱柱。

6.根据权利要求1-3任一所述的一种咔喏霉素中有关物质的检测方法，其特征在于，以ph4.6的磷酸二氢铵溶液为流动相a。

7.根据权利要求3或4所述的一种咔喏霉素中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件中流速为09-1.1ml/min。

8.根据权利要求3或4所述的一种咔喏霉素中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件中，进样量为20μl；流速为1.0ml/min；柱温为30℃，检测波长为220nm。

技术总结
本发明涉及咔喏霉素中有关物质的检测方法，采用高效液相色谱对咔喏霉素有关物质进行定性定量检测。本发明为咔喏霉素中有关物质的检测提供了一种准确有效的检测方法，保证咔喏霉素相关产品质量。

技术研发人员：务勇圣,周剑波,王思瑶,王怡,张勇纯,任萍,王超凡,李佳一,郑顺亮,颜冬兰,郝明,赵孝玉
受保护的技术使用者：九芝堂股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13