一种利用UPLC-MS/MS快速检测药物在Caco-2细胞模型中渗透性的方法与流程

本发明涉及一种利用uplc-ms/ms快速检测药物在caco-2细胞模型中渗透性的方法，属于药学研究领域。

背景技术：

1、小分子药物最常用的给药途径是口服给药。很多候选药物在临床前开发过程中由于其不能有效通过肠道吸收而导致生物利用度很低，从而导致药物开发失败，因此需要对候选药物在肠道中的渗透性进行详细的研究与鉴定。临床前研究手段分为体外渗透模型与动物体内pk实验。

2、caco-2渗透模型是一种常用的体外渗透模型。caco-2细胞是一种人肠道癌症细胞，与小肠上皮细胞在形态上十分相似，同源性好，不会产生上皮细胞形态学和生理学性质上的种属差异；具有相同的细胞极性且紧密连接，在小肠上皮细胞中的各种转运系统、代谢酶等在caco-2细胞中都有相同的存在，可以从不同方向进行摄取和转运渗透实验，可用于区分肠腔内吸收的差别。为了模拟化合物在小肠中的吸收过程，我们常用caco-2细胞来测定药物的渗透性，用于研究药物双向转运情况，通过考察时间、药物浓度等因素，计算药物的表观渗透系数。

3、药物检测分析方法目前报道的有高效液相色谱(hplc)和液相色谱-串联质谱法(lc-ms/ms)，这两种方法都能有效检测药物浓度，但是目前报道的分析方法都存在样品需求量大、分析方法时间长、检测精度低等缺点，不能满足高通量生物分析检测的需求。

4、因此建立一个更快速、更稳定、灵敏度高及检测精度高的检测方法是研究新药开发及药物渗透性的关键。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种利用uplc-ms/ms快速检测药物在caco-2细胞模型中的渗透性的方法，所述方法通量大、准确度高、更快速、更稳定、灵敏度高；可用于区分不同药物的渗透性，适用范围广，可用于原料药、制剂、大小分子的跨肠膜研究。

2、技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供一种利用uplc-ms/ms快速检测药物在caco-2细胞模型中的渗透性的方法，所述方法包括以下步骤：

3、(1)将caco-2细胞接种于transwell-24孔板里培养21～25天，形成caco-2致密细胞层，所述caco-2致密细胞层从上至下包括顶膜侧、单细胞层、滤膜和基底膜侧，所述caco-2致密细胞层包括给药端和接收端；

4、(2)在所述caco-2致密细胞层的给药端设置含有待测药品的缓冲溶液，接收端设置空白缓冲溶液，孵育，分别在给药端和接收端收样；

5、(3)在给药端和接收端的样品溶液中分别加入内标溶液，涡旋震荡，离心；取上清液，并加入超纯水复溶，封膜，摇板，利用uplc-ms/ms分析检测，进行渗透性测试，并计算待测药物的表观渗透系数；

6、(4)当待测药物的表观渗透系数大于4×10-6时，待测药物为高渗透性药物；

7、当待测药物的表观渗透系数为1×10-6～4×10-6时，待测药物为中渗透性药物；

8、当待测药物的表观渗透系数小于1×10-6时，待测药物为低渗透性药物。

9、其中，步骤(1)中所述caco-2细胞的种板密度为(0.8～1.2)×105细胞/cm2；所述致密细胞层的电阻不小于200欧姆/cm2。

10、其中，当给药端在顶膜侧时，接收端则在基底膜侧，给药端溶液与接收端溶液体积比为1:4；当给药端在基底膜侧时，接收端则在顶膜侧，接收端溶液与给药端溶液体积比为1:4。

11、其中，将步骤(2)中所述孵育时间为90～150min；当给药端在顶膜侧，接收端在基底侧时，所述给药端收样量为100～180μl，所述接收端收样量为500～700μl；当给药端在基底侧，接收端在顶膜侧时，所述接收端收样量为100～180μl，所述给药端收样量为500～700μl。

12、其中，将步骤(3)中所述给药端和接收端的收样总体积与内标溶液的体积比为1:0.5～1:2；所述内标溶液包括甲苯磺丁脲；所述超纯水的加入量为100～200μl/孔。

13、其中，步骤(4)中所述表观渗透系数：

14、其中，vr是接收端溶液的体积，area是细胞单层的相对表面积，time是孵育时间，c0是给药端待测药品的起始浓度，cr为接收端待测药品的终浓度。

15、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

16、1、本发明利用uplc-ms/ms检测caco-2渗透模型中药品渗透性的方法具有通量大、准确度高、更快速、更稳定、灵敏度高等特点；2、本发明的方法可用于区分不同药物的渗透性，适用范围广，可用于原料药、制剂、大小分子的跨肠膜研究。

技术特征：

1.一种利用uplc-ms/ms快速检测药物在caco-2细胞模型中的渗透性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的检测caco-2渗透模型中药品渗透性的方法，其特征在于，步骤(1)中所述caco-2细胞的种板密度为(0.8～1.2)×105细胞/cm2；所述致密细胞层的电阻不小于200欧姆/cm2。

3.根据权利要求1所述的检测caco-2渗透模型中药品渗透性的方法，其特征在于，当给药端在顶膜侧时，接收端则在基底膜侧，给药端溶液与接收端溶液体积比为1:4；当给药端在基底膜侧时，接收端则在顶膜侧，接收端溶液与给药端溶液体积比为1:4。

4.根据权利要求3所述的检测caco-2渗透模型中药品渗透性的方法，其特征在于，将步骤(2)中所述孵育时间为90～150min；当给药端在顶膜侧，接收端在基底侧时，所述给药端收样量为100～180μl，所述接收端收样量为500～700μl；当给药端在基底侧，接收端在顶膜侧时，所述接收端收样量为100～180μl，所述给药端收样量为500～700μl。

5.根据权利要求1所述的检测caco-2渗透模型中药品渗透性的方法，其特征在于，将步骤(3)中所述给药端和接收端的收样总体积与内标溶液的体积比为1:0.5～1:2；所述内标溶液包括甲苯磺丁脲；所述超纯水的加入量为100～200μl/孔。

6.根据权利要求1所述的检测caco-2渗透模型中药品渗透性的方法，其特征在于，

技术总结
本发明公开了一种利用UPLC‑MS/MS快速检测药物在Caco‑2细胞模型中的渗透性的方法。所述方法具有通量大、准确度高、更快速、更稳定、灵敏度高等特点；可用于区分不同药物的渗透性，适用范围广，可用于原料药、制剂、大小分子的跨肠膜研究。

技术研发人员：何孟奇,樊阿莉,陈梦迪,胡惠影,聂加倍,程远国,张雪峰
受保护的技术使用者：江苏鼎泰药物研究（集团）股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12