一种多光子作用截面的测量方法及装置

本发明涉及荧光成像，尤其涉及一种多光子作用截面的测量方法及装置。

背景技术：

1、多光子显微成像(multi-photon microscopy，mpm)是一种非线性光学成像技术，在高光子密度的长波长光的照射下，荧光分子能够同时吸收两个或者以上光子后，从低能态跃迁到高能态，并在衰变过程中重新向低能态跃迁并发出荧光。多光子显微成像根据激发同一荧光信号需要同时吸收的光子数可分为双光子显微成像，三光子显微成像和四光子显微成像等。

2、在相关技术中，多光子激发波长历经了800nm窗口、1300nm窗口以及1680nm窗口的演化。然而，对于最后的深层组织成像2200nm窗口，缺乏相关的研究，从而无法表征2200nm处的多光子激发。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种多光子作用截面的测量方法及装置，旨在解决相关技术中因对2200nm窗口激发的多光子成像缺乏相关研究，导致无法表征2200nm处的多光子激发的问题。

2、为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种多光子作用截面的测量方法，包括：

3、确定待测激发波长的目标激发模态类型；其中，激发模态类型包括以下任意一种：三光子激发模态和四光子激发模态；

4、基于所述目标激发模态类型，获取目标作用截面值比值公式；其中，作用截面值比值公式包括以下任意一种：三光子比值公式和四光子比值公式；

5、将同一激发模态类型的参考激发波长作用截面值输入至所述目标作用截面值比值公式，计算得到所述待测激发波长的作用截面值。

6、优选地，所述基于所述目标激发模态类型，获取目标作用截面值比值公式的步骤，包括：

7、当所述目标激发模态类型为三光子激发模态时，获取所述三光子比值公式；

8、当所述目标激发模态类型为四光子激发模态时，获取所述四光子比值公式。

9、优选地，所述三光子比值公式表示为：

10、

11、其中，下标0和1分别表示参考样品和待测样品，ησ是作用截面，p是激发波长焦点处的功率，τ是激发波长的脉冲宽度，s是荧光信号计数，c是样品的摩尔浓度，λ是激发波长。

12、优选地，所述四光子比值公式表示为：

13、

14、其中，下标0和1分别表示参考样品和待测样品，ησ是作用截面，p是激发波长焦点处的功率，τ是激发波长的脉冲宽度，s是荧光信号计数，c是样品的摩尔浓度，λ是激发波长。

15、优选地，所述确定待测激发波长的目标激发模态类型的步骤，包括：

16、基于样品的多组荧光信号的信号值与多组激发功率的一一对应关系，得到待测激发波长的第一特性表征斜率和参考激发波长的第二特性表征斜率；

17、根据所述第一特性表征斜率和预设特性表征斜率的相似度、以及所述第二特性表征斜率和预设特性表征斜率的相似度大小，确定待测激发波长的目标激发模态类型。

18、优选地，所述根据所述第一特性表征斜率和预设特性表征斜率的相似度、以及所述第二特性表征斜率和预设特性表征斜率的相似度大小，确定待测激发波长的目标激发模态类型的步骤，包括：

19、将所述第一特性表征斜率和预设特性表征斜率作差得到第一差值，所述第二特性表征斜率和预设特性表征斜率作差得到第二差值；

20、当所述预设特性表征斜率为三且所述第一差值和所述第二差值均小于预设阈值时，确定待测激发波长的目标激发模态类型为三光子激发模态；

21、当所述预设特性表征斜率为四且所述第一差值和所述第二差值均小于预设阈值时，确定待测激发波长的目标激发模态类型为四光子激发模态。

22、优选地，所述基于样品的多组荧光信号的信号值与多组激发功率的一一对应关系，得到待测激发波长的第一特性表征斜率和参考激发波长的第二特性表征斜率的步骤，包括：

23、对多组所述待测样品荧光信号的信号值与激发功率组成的映射参数进行线性拟合:得到第一拟合直线，并将所述第一拟合直线的斜率作为待测激发波长的第一特性表征斜率；

24、对多组所述参考样品荧光信号的信号值与激发功率组成的映射参数进行线性拟合得到第二拟合直线，并将所述第二拟合直线的斜率作为待测激发波长的第二特性表征斜率。

25、本发明第二方面还提供了一种多光子作用截面测量装置，采用如上任意一项所述的测量方法中的步骤测量多光子作用截面，所述多光子作用截面测量装置包括激光器、半波片、偏振分束器、频率调制组件、二向色镜、物镜、光电倍增管、预放大器以及光子计数器，所述激光器发射的激光依次经过所述半波片、所述偏振分束器、所述频率调制组件、所述二向色镜和所述物镜，并经所述物镜投射至待测样品，所述物镜收集的荧光背向传输至所述二向色镜，并被所述二向色镜反射至所述光电倍增管的探测面上，所述预放大器电连接于所述光电倍增管，所述光子计数器电连接于所述预放大器。

26、优选地，所述频率调制组件包括第一透镜组、保偏大模场光纤、第二透镜组以及第一滤光片，所述激光器发射的激光依次经过所述第一透镜组、所述保偏大模场光纤、所述第二透镜组以及所述第一滤光片。

27、优选地，所述多光子作用截面测量装置还包括第二滤光片和第三透镜组，被所述二向色镜反射后的荧光依次经过所述第二滤光片和所述第三透镜组后传输至所述光电倍增管的探测面上。

28、本发明中一种多光子作用截面的测量方法及装置与现有技术相比，有益效果在于：通过确定待测激发波长的目标激发模态类型；基于目标激发模态类型，获取目标作用截面值比值公式；将同一激发模态类型的参考激发波长作用截面值输入至目标作用截面值比值公式，计算得到待测激发波长的作用截面值。采用荧光比较法，并基于已知的1680nm激发波长的作用截面值获取2200nm激发波长的作用截面值，实现2200nm窗口荧光标记物的三光子激发模态和四光子激发模态的作用截面测量，从而能够表征2200nm处的多光子激发。

技术特征：

1.一种多光子作用截面的测量方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的多光子作用截面的测量方法，其特征在于，所述基于所述目标激发模态类型，获取目标作用截面值比值公式的步骤，包括：

3.根据权利要求2所述的多光子作用截面的测量方法，其特征在于，所述三光子比值公式表示为：

4.根据权利要求2所述的多光子作用截面的测量方法，其特征在于，所述四光子比值公式表示为：

5.根据权利要求1所述的多光子作用截面的测量方法，其特征在于，所述确定待测激发波长的目标激发模态类型的步骤，包括：

6.根据权利要求5所述的多光子作用截面的测量方法，其特征在于，所述根据所述第一特性表征斜率和预设特性表征斜率的相似度、以及所述第二特性表征斜率和预设特性表征斜率的相似度大小，确定待测激发波长的目标激发模态类型的步骤，包括：

7.根据权利要求5所述的多光子作用截面的测量方法，其特征在于，所述基于样品的多组荧光信号的信号值与多组激发功率的一一对应关系，得到待测激发波长的第一特性表征斜率和参考激发波长的第二特性表征斜率的步骤，包括：

8.一种多光子作用截面测量装置，其特征在于，采用权利要求1至7中的任意一项所述的测量方法中的步骤测量多光子作用截面，所述多光子作用截面测量装置包括激光器、半波片、偏振分束器、频率调制组件、二向色镜、物镜、光电倍增管、预放大器以及光子计数器，所述激光器发射的激光依次经过所述半波片、所述偏振分束器、所述频率调制组件、所述二向色镜和所述物镜，并经所述物镜投射至待测样品，所述物镜收集的荧光背向传输至所述二向色镜，并被所述二向色镜反射至所述光电倍增管的探测面上，所述预放大器电连接于所述光电倍增管，所述光子计数器电连接于所述预放大器。

9.根据权利要求8所述的多光子作用截面测量装置，其特征在于，所述频率调制组件包括第一透镜组、保偏大模场光纤、第二透镜组以及第一滤光片，所述激光器发射的激光依次经过所述第一透镜组、所述保偏大模场光纤、所述第二透镜组以及所述第一滤光片。

10.根据权利要求8所述的多光子作用截面测量装置，其特征在于，所述多光子作用截面测量装置还包括第二滤光片和第三透镜组，被所述二向色镜反射后的荧光依次经过所述第二滤光片和所述第三透镜组后传输至所述光电倍增管的探测面上。

技术总结
本发明提供了一种多光子作用截面的测量方法及装置，测量方法包括：确定待测激发波长的目标激发模态类型；其中，激发模态类型包括以下任意一种：三光子激发模态和四光子激发模态；基于目标激发模态类型，获取目标作用截面值比值公式；其中，作用截面值比值公式包括以下任意一种：三光子比值公式和四光子比值公式；将同一激发模态类型的参考激发波长作用截面值输入至目标作用截面值比值公式，计算得到待测激发波长的作用截面值。采用荧光比较法，并基于已知的1680nm激发波长的作用截面值获取2200nm激发波长的作用截面值，实现2200nm窗口荧光标记物的三光子激发模态和四光子激发模态的作用截面测量，从而能够表征2200nm处的多光子激发。

技术研发人员：王科,邱娉,钟金成,仝申
受保护的技术使用者：深圳大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12