一种精氨酸或盐酸精氨酸的含量测定方法与流程

本发明涉及一种精氨酸或盐酸精氨酸的含量测定方法，属医药。

背景技术：

1、近年来随着组织工程学的蓬勃发展，组织修复材料的研究方兴未艾。随着对原位组织再生理解的不断深入，组织工程的研究方向逐渐向基于药物和修复材料结合上转变，如在天然骨的基础上对其进行优化，添加功能蛋白等生物活性因子，再经过冷冻干燥等处理制成最终产品。然而，在温度降低和干燥失水等条件下存在多种因素会对功能蛋白等活性因子产生影响，因此在冻干制品中通常使用两种类型以上的保护剂，以维持功能蛋白等活性因子在冷冻干燥过程中的活性。

2、常用的保护剂种类有多羟基化合物、糖类、氨基酸及其盐酸盐等。精氨酸是常用的氨基酸类功能蛋白保护剂之一，也是人体自身能合成的一种营养素，其能够在冷冻状态下增加水的表面张力，提高功能蛋白的稳定性，通常制成盐酸盐形式。盐酸精氨酸作为一种理想的保护剂，通常与其他类型保护剂共同添加到修复材料中以对蛋白成分的生物活性分子产生保护作用，所以对其含量的测定有利于产品质量的控制。

3、目前精氨酸的相关制剂及原料的检测方法主要有滴定、旋光、衍生化和高效液相色谱法。无论是滴定法还是旋光度法，其操作繁琐费时，且专属性不强，容易受其他成分干扰而影响测定，且中国药典中记载的盐酸精氨酸含量测定方法为醋酸汞电位滴定法，醋酸汞有剧毒，易对实验人员带来威胁；衍生化法虽然可以提高专属性，但其容易损坏色谱柱，且衍生化试剂用量、种类等条件易对结果准确度造成影响，衍生试剂昂贵，且多数具有毒性，衍生过程时间长；而高效液相色谱法分析成本高，仪器、色谱柱购置价格高，有机溶剂用量大，不够经济、环保。

4、由于目前盐酸精氨酸(或精氨酸)测定方法的局限性和不足，相较于制剂及原料这类主成分含量较高的体系，对材料中添加量较低且同时含有其他类型保护剂成分体系中的盐酸精氨酸(或精氨酸)测定具有更大挑战，对检测方法专属性、灵敏度、准确度提出更高要求，亟需一种操作简单、灵敏快速、准确度高的测定方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种盐酸精氨酸或精氨酸的测定方法，尤其对于检测体系中同时含有氨基酸(20种常见氨基酸)、糖类(蔗糖/葡萄糖)成分且盐酸精氨酸(或精氨酸)含量较低时的测定，该方法操作简便、检测迅速、准确高效、安全经济。

2、本发明提供的精氨酸或盐酸精氨酸的含量测定方法，包括如下步骤：

3、s1、配制含有不同浓度的精氨酸或盐酸精氨酸的标准溶液，向所述标准溶液中加入氢氧化钾溶液和α-萘酚溶液，室温静置后再加入次氯酸钠溶液进行反应，测定所述标准溶液的吸光度，根据所述标准溶液中所述精氨酸或所述盐酸精氨酸的浓度与相应的吸光度制作标准曲线；

4、s2、向待测试剂中加入所述氢氧化钾溶液和α-萘酚溶液，室温静置后再加入所述次氯酸钠溶液进行反应，测定体系的吸光度，根据所述标准曲线，即得到所述待测试剂中所述精氨基或所述盐酸精氨酸的含量；

5、步骤s2和s3中，所述室温静置和所述反应的条件相同；

6、所述待测试剂可为精氨酸蛋白保护剂。

7、上述的含量测定方法中，所述氢氧化钾的用量为(0.02g～0.1g)/ml所述标准溶液或所述待测试剂。

8、上述的含量测定方法中，所述α-萘酚溶液的浓度为0.05％，可采用无水乙醇进行稀释；

9、所述0.05％α-萘酚溶液的用量为(0.02ml～0.06ml)/ml所述标准溶液或所述待测试剂。

10、上述的含量测定方法中，所述静置的时间为4min～30min。

11、上述的含量测定方法中，所述次氯酸钠溶液由次氯酸钠标准溶液(0.05025mol/l)稀释得到，可采用1mol/l naoh溶液进行稀释；

12、所述次氯酸钠标准溶液的用量为(0.1ml～0.3ml)/ml所述标准溶液或所述待测试剂。

13、上述的含量测定方法中，在检测波长为520nm的条件下检测所述吸光度。

14、上述的含量测定方法中，采用酶标仪或分光光度计检测所述吸光度，优选酶标仪。

15、上述的含量测定方法中，所述待测试剂中，所述精氨基或所述盐酸精氨酸的浓度最低为10μg/ml。

16、不同于现有的盐酸精氨酸或精氨酸含量的测定方法，本发明提供的方法，操作简便、检测迅速、安全经济，不同于各国药典及相关专利及文献中公开的定量测定方法。

17、通过商业途径获得到精氨酸(arg)检测试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司，货号ceb938ge)，其原理为酶联免疫吸附试验法，待测标本浓度越高，标记抗原和抗体的结合就越受到抑制，显色愈浅，显色的深浅与样品中待测物质含量呈负相关，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度进行计算。在尝试采用该方法进行试验时，发现待测样品所示吸光度数值基本与空白孔相同，无梯度趋势，分析原因可能是因为如果待测样品中的精氨酸来源与试剂盒中精氨酸抗体来源不同的话，就无法与试剂盒精氨酸抗体特异性结合，出现假阴性而无法准确检测。因此根据该elisa试剂盒的原理，其应用具有一定的局限性，仅适用于相同来源的精氨酸检测。

18、黄松等人在《茚三酮比色法测定青天葵中总游离氨基酸的含量》一文中公开了利用α-氨基酸与茚三酮反应产生颜色测定吸光度变化的原理进行氨基酸含量测定。本发明的发明人在尝试采用该方法进行同时含有氨基酸、糖类成分的盐酸精氨酸溶液时，发现标准曲线及样品回收率不佳，结合文献资料分析发现是由于在ph大于3且加热情况下体系中若同时含有糖类和氨基酸类成分，极易发生美拉德反应，从而影响盐酸精氨酸的检测准确性。

19、李金屏等人在《盐酸精氨酸注射液比色测定法的研究》一文中公开了盐酸精氨酸注射液的含测定方法，以溴、氢氧化钠、氢氧化钾、α-萘酚为反应试剂，在一定的显色条件下，采用751型分光光度计，检测波长为520nm，测定吸光度进行注射液中盐酸精氨酸含量计算。该方法用到的试剂溴有毒且有刺激性，易对实验人员操作带来威胁且增加了购买储存的不便性；该方法使用的751型分光光度计，只能对各个实验样品单独检测，无法在短时间内实现批量检测，若检测时间增长易增加待测液显色的不稳定性，从而影响试验准确性。

20、上述试验虽通过显色反应，采用比色法定量检测盐酸精氨酸，但由于其反应体系主要为精氨酸，成分相对简单，而由于反应过程受很多因素的影响，忽略这些因素的话，可能会使试验产生一定的误差，因此对于同时含有其他类型成分的反应体系可能并不适用，且短时间无法实现多批量检测。因此本发明的发明人通过实验原理分析，评估显色反应的影响因素和多次科学试验，巧妙的提供了一种简便快速的盐酸精氨酸(或精氨酸)含量的测定方法，该方法可避免大量有机溶剂及剧毒试剂的使用，检测灵敏度高、检测限低，而且可用于同时含有氨基酸(20种常见氨基酸)、糖类(蔗糖/葡萄糖)成分的盐酸精氨酸(或精氨酸)溶液检测，安全可靠，且能在相同时间内实现数十倍样品测定，极大地提高了检测效率。

技术特征：

1.一种精氨酸或盐酸精氨酸的含量测定方法，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于：所述氢氧化钾的用量为(0.02g～0.1g)/ml所述标准溶液或所述待测试剂。

3.根据权利要求1或2所述的含量测定方法，其特征在于：所述α-萘酚溶液的浓度为0.05％，采用无水乙醇进行稀释；

4.根据权利要求1-3中任一项所述的含量测定方法，其特征在于：所述静置的时间为4min～30min。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的含量测定方法，其特征在于：所述次氯酸钠溶液由次氯酸钠标准溶液稀释得到，采用1mol/l naoh溶液进行稀释；

6.根据权利要求1-5中任一项所述的含量测定方法，其特征在于：在检测波长为520nm的条件下检测所述吸光度。

7.根据权利要求6所述的含量测定方法，其特征在于：采用酶标仪或分光光度计检测所述吸光度。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的含量测定方法，其特征在于：所述待测试剂中，所述精氨酸或所述盐酸精氨酸的浓度最低为10μg/ml。

技术总结
本发明公开了一种精氨酸或盐酸精氨酸的含量测定方法。所述方法包括如下步骤：S1、配制含有不同浓度的精氨酸或盐酸精氨酸的标准溶液，向标准溶液中加入氢氧化钾溶液和α‑萘酚溶液，室温静置后再加入次氯酸钠溶液进行反应，测定标准溶液的吸光度，根据标准溶液中精氨酸或盐酸精氨酸的浓度与相应的吸光度制作标准曲线；S2、向待测试剂中加入氢氧化钾溶液和α‑萘酚溶液，室温静置后再加入次氯酸钠溶液进行反应，测定体系的吸光度，根据标准曲线即得。本发明方法可避免大量有机溶剂及剧毒试剂的使用，检测灵敏度高、检测限低，而且可用于同时含有氨基酸、糖类成分的盐酸精氨酸(或精氨酸)溶液检测，安全可靠，能在相同时间内实现数十倍样品测定，极大提高了检测效率。

技术研发人员：马军,刘启省,吕海鸾,彭继学,张东刚,于秋航,李宇彤
受保护的技术使用者：烟台正海生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12