五神汤的指纹图谱检测方法

本发明属于中药检测，具体涉及一种五神汤的指纹图谱检测方法。

背景技术：

1、五神汤最早出自清·陈士铎的《洞天奥旨·卷七·骨痈》(公元1694年)，处方由金银花、紫花地丁、牛膝、茯苓和车前子5味药材组成。目前在临床上五神汤主要用于慢性骨髓炎的治疗，其中金银花做君药，辅以紫花地丁，茯苓、车前子为佐使、牛膝为使药。五神汤利湿解毒，方中金银花、紫花地丁清热解毒、凉血消肿；茯苓、车前子利尿通淋、渗湿止渴；牛膝活血散瘀、引血下行。五药合用，既解毒，又利湿。目前，对于五神汤的研究较少且多停留在临床应用方面，但没有深入分析内在药效成分的差异对五神汤质量的影响。

2、因此，很有必要在现有的仪器分析技术基础上，建立五神汤的高效液相色谱指纹特征图谱，并通过中药色谱特征图谱相似度评价系统对其进行分析，建立对照指纹图谱，为五神汤的质量控制提供依据，具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的中药复方制剂在含量控制上基本只有一个或两个指标性成分，质量控制单一，指标少，存在难以全面反映药味多，组分多、靶标多的五神汤组合物的质量状况的缺陷，从而提供五神汤指纹图谱的建立方法及指纹图谱。

2、本发明提供如下技术方案：五神汤指纹图谱的建立方法，采用高效液相色谱法，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相a，0.1％磷酸的水溶液为流动相b，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，进样量为10μl，检测波长为254nm，，按下表进行梯度洗脱

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4、在一些实施方案中，所述色谱柱为aglient eclipse xdb-c18，规格为4.6×150mm，5μm。

5、在一些实施方案中，五神汤指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

6、供试品溶液的制备：精密称定五神汤药材粉末，置具塞锥形瓶中，加入甲醇提取，取提取液放冷至室温后再次称重，并用甲醇溶液补足缺失的重量。离心，取上清液用滤膜过滤，取续滤液即得五神汤供试品溶液；

7、混合对照品溶液的制备：精密称取秦皮甲素、秦皮乙素、木犀草苷、β-蜕皮甾酮、京尼平苷酸、咖啡酸、绿原酸、毛蕊花糖苷对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容摇匀，用微孔滤膜滤过，得混合对照品溶液。

8、在一些实施方案中，五神汤指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

9、供试品溶液制备：精密称取金银花4.65g、紫花地丁1.55g、牛膝0.725g、车前子1.55g、茯苓1.55g，粉碎成粉末后混合均匀，精密称取1g，置具塞锥形瓶中，加入10ml体积浓度50％甲醇，超声提取40min，取出，取续滤液，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得五神汤供试品溶液。

10、混合对照品溶液的制备：精密称取秦皮甲素对照品10.39mg，秦皮乙素对照品10.56mg，木犀草苷对照品9.28mg，β-蜕皮甾酮对照品14.48mg，京尼平苷酸对照品8.90mg，咖啡酸对照品11.34mg，绿原酸对照品10.63mg和毛蕊花糖苷对照品9.54mg，置于25ml容量瓶中，加50％甲醇溶解并定容摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，得到浓度分别为415.60、422.40、371.20、579.20、356.00、453.60、425.20、381.60mg/ml的秦皮甲素、秦皮乙素、木犀草苷、b-蜕皮甾酮、京尼平苷酸、咖啡酸、绿原酸、毛蕊花糖苷的混合对照品溶液。

11、色谱条件：色谱柱为aglient eclipse xdb-c18，规格为4.6×150mm，5μm；以乙腈为流动相a，0.1％磷酸的水溶液为流动相b；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样量为10μl；检测波长为254nm；按下表进行梯度洗脱；

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13、测定：精密吸取供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪，按高效液相色谱法测定，得到五神汤指纹图谱。

14、上述方法所述指纹图谱包括10个共有峰，各峰保留时间如图2所示。

15、所述的五神汤指纹图谱检测方法应用于五神汤的质量控制，以指纹图谱相似度应大于0.90为检验质控标准。

16、本发明的有益效果：本发明根据五神汤中所含的活性成分，包括苷类、黄酮类、甾体类、有机酸、生物碱等的结构性质特点，通过实验筛选出最佳的流动相组成、梯度洗脱程序、检测波长、色谱柱、柱温等色谱分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的五神汤指纹图谱检测方法可以全面、客观、准确的检测和评价五神汤的质量，为保证患者用药安全有效具有重要意义

技术特征：

1.五神汤指纹图谱的测定方法，采用高效液相色谱法，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相a，0.1％磷酸的水溶液为流动相b，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，进样量为10μl，检测波长为254nm，，按下表进行梯度洗脱

2.根据权利要求1所述的五神汤指纹图谱的测定方法，其特征在于，所述色谱柱为aglient eclipse xdb-c18，规格为4.6×150mm，5μm。

3.根据权利要求1所述的五神汤指纹图谱的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求1所述的五神汤指纹图谱的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求1所述的方法测得的五神汤指纹图谱包括19个共有峰，各峰保留时间如图2所示。

6.根据权利要求1所述的五神汤指纹图谱测定方法应用于五神汤的质量控制，以指纹图谱相似度应大于0.90为检验质控标准。

技术总结
本发明公开了一种五神汤的指纹图谱测定方法。该方法包括：步骤1：五神汤供试品溶液的制备；步骤2：混合标准品的制备；步骤3：分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；步骤4：将步骤3中获得的五神汤指纹图谱的数据文件从仪器中导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次五神汤的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成五神汤的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。本发明所提供的五神汤指纹图谱检测方法，稳定性好、精密度高、重现性好，能全面，客观地表征五神汤的质量。

技术研发人员：高珣,王冉,秦昆明,吴文静
受保护的技术使用者：江苏海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11