一种发酵豆制品中游离氨基酸的检测方法与流程

本发明涉及发酵豆制品游离氨基酸检测，具体为一种发酵豆制品中游离氨基酸的检测方法。

背景技术：

1、在大豆发酵过程中，蛋白质在蛋白酶的作用下水解为多肽及小分子肽链，小分子肽链继续水解为游离氨基酸，游离氨基酸的生成大大提高了蛋白质的消化率，更有利于人体消化、吸收利用。因此，游离氨基酸的含量是衡量发酵产品风味和营养的一个重要指标。氨基酸不但营养价值高，也是重要的呈味物质，特别是游离氨基酸，是发酵豆制品独特风味形成的重要因素。因此快速检测出发酵食品中的游离氨基酸含量并能够准确分析18种游离氨基酸的含量，从而能够更加全面和精准的评价发酵豆制品的营养价值。现有的发酵豆制品氨基酸检测方法，单次氨基酸检测种类有待提高，同时对于样品前处理时间长，样品检测时间长，整体检测效率低。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种发酵豆制品中游离氨基酸的检测方法，解决了现有的发酵制品氨基酸检测方法检测种类少、样品前处理与检测时间耗时长，整体检测效率低的问题。

3、(二)技术方案

4、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种发酵豆制品中游离氨基酸的检测方法，通过高效液相色谱－质谱联用仪测定发酵豆制品中胱氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、脯氨酸、组氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸18种游离氨基酸的含量，具体包括以下步骤：

5、步骤1、设定色谱条件与质谱条件：

6、色谱条件：采用discovery hs f5-3色谱柱，流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为乙腈，采用梯度洗脱：0～1min，95％流动相a保持不变；1～6min，90％流动相a线性变化至10％流动相a；6～8min，10％流动相a保持不变；8.1min变化至95％流动相a，平衡2min，柱温：35℃，流速：0.3ml/min，进样量：2μl；

7、质谱条件：电喷雾离子源，正电离模式；加热气温度400℃，干燥气流速10l/min，雾化气流量3l/min，接口温度300℃，dl管温度250℃，脱溶剂温度526℃，反应模式：mrm；

8、步骤2、配制混合氨基酸标准中间液：吸取1.0ml的18种混合氨基酸标准储备液于10ml容量瓶中，用0.1mol/l盐酸溶液稀释并定容至刻度，混匀，配制成质量浓度均为250nmol/ml的18种混合氨基酸标准中间液；

9、步骤3、配制混合氨基酸标准工作溶液：分别吸取1.0ml的18种混合氨基酸标准中间液于10ml容量瓶中，用50％乙腈溶液稀释并定容至刻度，混匀，得第一份标准工作溶液；

10、步骤4、将第一份标准工作溶液用50％乙腈溶液逐级稀释，制成总共7个不同浓度的系列18种游离氨基酸混合标准工作溶液；7个浓度的18种游离氨基酸混合标准工作溶液中18种混合氨基酸的质量浓度均为：0.1nnmol/ml，0.2nnmol/ml，0.5nnmol/ml，0.8nnmol/ml，1.0nnmol/ml，1.5nnmol/ml，2nnmol/ml现配现用；

11、步骤5、制备样品待测液：称取2.0g发酵豆制品样品，于250ml锥形瓶中，加入200ml沸水浸提，95℃水浴加热每隔5min混匀一次提取10min后取出，趁热抽滤，滤液冷却至室温后，用水定容至250ml，混匀后取适量样品溶液，经0.45um水相滤膜过滤后得到待测提取液；

12、步骤6、移取1ml步骤5中的提取液于10ml容量瓶中，用50％乙腈溶液稀释并定容至刻度混匀取2ml稀释液于4℃，14000r/min下离心10min，取适量上清液待测；

13、步骤7、使用初始流动相将18种游离氨基酸混合标准工作溶液稀释成系列质量浓度标准溶液，进行液相色谱－串联质谱分析，以标准工作液质量为横坐标，各氨基酸峰面积为纵坐标制作标准曲线，分析各氨基酸标准曲线的相关系数r2以及线性相关程度；

14、步骤8、取18种游离氨基酸混合标准工作溶液用50％乙腈水溶液稀释后测定，以3倍信噪比作为方法的检出限，以10倍信噪比作为方法的定量限，获得目标物的检出限和定量限，获得18种游离氨基酸的检出限为2.44-6.36ug/kg，定量限为8.05-20.99ug/kg

15、优选的，所述步骤1中离子对、碰撞能量见表1：

16、

17、

18、优选的，所述步骤7中初始流动相为10％流动相a与90％的流动相b的混合溶液。

19、优选的，所述步骤7使用初始流动相将18种游离氨基酸混合标准工作溶液稀释成10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、500ng/ml系列质量浓度标准溶液。

20、(三)有益效果

21、本发明具备以下有益效果：

22、该发酵豆制品中游离氨基酸的检测方法，通过采用的液相色谱－串联质谱法作为游离氨基酸的检测方法分析时间更短，检出浓度更低，检出限为2.44-6.36ug/kg，定量限为8.05-20.99ug/kg，适用于徽州毛豆腐等发酵豆制品中18种游离氨基酸含量的检测。本方法试验检测结果显示18种游离氨基酸的线性关系良好，相关系数均大于0.995，加标回收率在83％～101％之间，相对标准偏差在0.2％～2.61％之间，说明采用此质谱方法进行检测结果良好，对18种游离氨基酸具有普遍适用性。

技术特征：

1.一种发酵豆制品中游离氨基酸的检测方法，其特征在于：通过高效液相色谱－质谱联用仪测定发酵豆制品中胱氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、脯氨酸、组氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸18种游离氨基酸的含量，具体包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种发酵豆制品中游离氨基酸的检测方法，其特征在于：所述步骤1中离子对、碰撞能量见表1：

3.根据权利要求2所述的一种发酵豆制品中游离氨基酸的检测方法，其特征在于：所述步骤7中初始流动相为10％流动相a与90％的流动相b的混合溶液。

4.根据权利要求3所述的一种发酵豆制品中游离氨基酸的检测方法，其特征在于：所述步骤7使用初始流动相将18种游离氨基酸混合标准工作溶液稀释成10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、500ng/ml系列质量浓度标准溶液。

技术总结
本发明涉及发酵豆制品游离氨基酸检测技术领域，公开了一种发酵豆制品中游离氨基酸的检测方法，包括如下步骤：步骤1、设定固定的色谱条件与质谱条件；步骤2、配制混合氨基酸标准中间液；步骤3、配制混合氨基酸标准工作溶液；步骤4、配制7个不同浓度的系列18种游离氨基酸混合标准工作溶液；步骤5制备样品待测液；步骤7、使用初始流动相将18种游离氨基酸混合标准工作溶液稀释成系列质量浓度标准溶液，进行液相色谱－串联质谱分析，制作标准曲线，分析各氨基酸标准曲线的相关系数R<supgt;2</supgt;以及线性相关程度；步骤8、获得目标物的检出限和定量限。本发明，对于样品提取方法简单、快速，可用于发酵豆制品中18种游离氨基酸的检测，对18种游离氨基酸的检测具有普遍适用性。

技术研发人员：杜恺,郝玉玲,武文文,刘坤,王明星
受保护的技术使用者：安徽科博产品检测研究院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13