一种基于功能化核孔膜的CA50抗原电化学检测方法与流程

本发明属于生物医学检测，具体涉及一种基于功能化核孔膜的ca50抗原电化学检测方法。

背景技术：

1、细胞表面的糖脂或糖蛋白在细胞的信息传递、生长和分化中起着重要作用。细胞恶变时，由于糖基转化酶的失活或某些胚胎时期活跃而成熟期趋于静止的一些转化酶被激活，从而引起细胞表面糖类的变化。ca(carbohydrate antigen)类抗原可认为是这种变化的结果，它们以神经节糖苷或是结合到糖蛋白中的形式出现在细胞上，测定这些肿瘤相关抗原是诊断恶性病变的有用指标。

2、在先的研究者在胰腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌等消化系统肿瘤以及子宫癌中发现了糖类抗原ca50，ca50抗原由肿瘤进入血液，因此，ca50是一种广谱的肿瘤标志物，ca50在血清中的含量与肿瘤组织的大小、转移与否、及病情严重程度有直接的定量关系，是用于上述相关恶性肿瘤例如胰腺癌早期诊断的一个有效指标。目前检测ca50常用的检测方法是化学发光法，该方法存在检测信号值衰减较快、高浓度和低浓度信号衰减速度不一致的缺点，限制了其在免疫定量分析中的低端检测灵敏度、稳定性和重复性。因此，开发一种检测速度快、灵敏度高、操作简便、成本低廉的检测方法具有十分重要的理论和实际意义。

技术实现思路

1、本发明提供一种基于功能化核孔膜的ca50抗原电化学检测方法。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种基于功能化核孔膜的ca50抗原电化学检测方法，其是在核孔膜的孔道内壁共聚耦合抗ca50抗体，之后使核孔膜孔道内壁上的抗ca50抗体与待检测体系中的ca50抗原结合，再通过电化学工作站检测电压变化时通过该功能化核孔膜孔通道的微电流变化，实现对抗原浓度的定量检测，其中，所述核孔膜孔道的孔径为0.01～10μm，所述核孔膜孔道的分布密度为5×104～2×1012个/cm2。进一步优选地，所述核孔膜的孔径均一度为40.2％～95.3％。

4、其中，核孔膜孔径均一度的定义为：孔径为孔径数值±5％孔径数值的孔占所有孔的比例。

5、进一步优选地，所述核孔膜孔道的孔径为0.01～2μm，所述核孔膜孔道的分布密度为108～2×1012个/cm2，所述核孔膜的孔径均一度为70％～95.3％。在此由多种参数范围定义的核孔膜内，功能化核孔膜对ca50抗原浓度检测灵敏度高，尤其在低浓度条件下电流变化明显，便于对低浓度ca50抗原进行检测，更有利于相关恶性肿瘤的早期发现和诊断。

6、在一些实施例中，所述核孔膜厚度为0.1～100μm，这样的厚度范围选择得到的核孔膜便于操作。

7、作为本发明方案的一种优选，在核孔膜的孔道内壁共聚耦合抗ca50抗体的方法包括：将核孔膜浸泡在含edc和nhs的混合溶液中反应，使核孔膜孔道内表面的羧基活化成反应性胺酯分子，将活化后的核孔膜取出，再将其浸入抗ca50抗体水溶液，室温孵育反应，之后取出共聚耦合有抗ca50抗体的核孔膜，清洗，晾干，得到用于ca50抗原电化学检测的功能化核孔膜。

8、其中，在一实施例中，混合溶液中edc的浓度为10～15mg/ml，所述nhs的浓度为1～5mg/ml，溶剂为0.1～0.3m的mes缓冲液；所述edc为n-(3-二甲氨基丙基)-n-乙基碳二酰亚胺盐酸盐的缩写；所述nhs为n-羟基磺基丁二酰亚胺的缩写。混合溶液中edc和nhs为过量添加。

9、在一些实施例中，所述核孔膜的材质选自聚对苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯或聚酰亚胺。

10、作为本发明方案的一种优选，所述方法包括：将功能化核孔膜在浓度为0.1～1nm的ca50抗原水溶液中孵育，孵育时间为1h以上，之后将孵育后的功能化核孔膜放入电解池夹具之间，在电解池中注入预定浓度的电解液，电解池两端插入电极后使用电化学工作站施加脉冲电压并检测通过捕获ca50抗原后的核孔膜的微电流变化，制作标准曲线。孵育时间过短会造成反应不充分。

11、作为本发明方案的一种优选，所述方法还包括：将功能化核孔膜在浓度待测的ca50抗原水溶液中孵育，孵育时间为1h以上，之后，将孵育后的功能化核孔膜放入电解池夹具之间，在电解池中注入一预定浓度的电解液，电解池两端插入电极后使用电化学工作站施加脉冲电压并检测通过捕获ca50抗原后的核孔膜的微电流变化。

12、优选的，所述电解液为0.5×pbs磷酸盐缓冲溶液标准溶液，所述电极为ag/agcl电极，所述电化学工作站施加的脉冲电压为-2～2v，每个脉冲电压持续时间5s。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

14、本发明首次提供了基于功能化核孔膜的ca50抗原电化学检测方法，其中，功能化核孔膜的制备反应温和、过程易控、操作简便、共价接枝率高，并且成本低；另一方面，通过电化学工作站检测通过该核孔膜孔通道的微电流变化实现对ca50抗原浓度的定量检测，并且提高了其监测灵敏度，并且能够检测到更低浓度的ca50抗原，具有灵敏度高、快速、特异性高、操作简便的特点，稳定性和重复性好，对肿瘤的早期发现和诊断、监测以及良、恶性肿瘤的早期鉴别有着十分重要的理论和实际意义。

技术特征：

1.一种基于功能化核孔膜的ca50抗原电化学检测方法，其特征在于，在核孔膜的孔道内壁共聚耦合抗ca50抗体，之后使核孔膜孔道内壁上的抗ca50抗体与待检测体系中的ca50抗原结合，再通过电化学工作站检测电压变化时通过该功能化核孔膜孔通道的微电流变化，实现对抗原浓度的定量检测，其中，所述核孔膜孔道的孔径为0.01～10μm，所述核孔膜孔道的分布密度为5×104～2×1012个/cm2。

2.根据权利要求1所述的基于功能化核孔膜的ca50抗原电化学检测方法，其特征在于，所述核孔膜的孔径均一度为40.2％～95.3％。

3.根据权利要求2所述的基于功能化核孔膜的ca50抗原电化学检测方法，其特征在于，所述核孔膜孔道的孔径为0.01～2μm，所述核孔膜孔道的分布密度为108～2×1012个/cm2，所述核孔膜的孔径均一度为70％～95.3％。

4.根据权利要求1所述的基于功能化核孔膜的ca50抗原电化学检测方法，其特征在于，在核孔膜的孔道内壁共聚耦合抗ca50抗体的方法包括：将核孔膜浸泡在含edc和nhs的混合溶液中反应，使核孔膜孔道内表面的羧基活化成反应性胺酯分子，将活化后的核孔膜取出，再将其浸入抗ca50抗体水溶液，室温孵育反应，之后取出共聚耦合有抗ca50抗体的核孔膜，清洗，晾干，得到用于ca50抗原电化学检测的功能化核孔膜。

5.根据权利要求4所述的基于功能化核孔膜的ca50抗原电化学检测方法，其特征在于，混合溶液中edc的浓度为10～15mg/ml，所述nhs的浓度为1～5mg/ml，溶剂为0.1～0.3m的mes缓冲液，并且混合溶液中edc和nhs为过量添加。

6.根据权利要求1所述的基于功能化核孔膜的ca50抗原电化学检测方法，其特征在于，所述核孔膜的材质选自聚对苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯或聚酰亚胺。

7.根据权利要求1所述的基于功能化核孔膜的ca50抗原电化学检测方法，其特征在于，所述方法包括：将功能化核孔膜在浓度为0.1～1nm的ca50抗原水溶液中孵育，孵育时间为1h以上，之后将孵育后的功能化核孔膜放入电解池夹具之间，在电解池中注入预定浓度的电解液，电解池两端插入电极后使用电化学工作站施加脉冲电压并检测通过捕获ca50抗原后的核孔膜的微电流变化，制作标准曲线。

8.根据权利要求7所述的基于功能化核孔膜的ca50抗原电化学检测方法，其特征在于，所述方法进一步包括：将功能化核孔膜在浓度待测的ca50抗原水溶液中孵育，孵育时间为1h以上，之后，将孵育后的功能化核孔膜放入电解池夹具之间，在电解池中注入预定浓度的电解液，电解池两端插入电极后使用电化学工作站施加脉冲电压并检测通过捕获ca50抗原后的核孔膜的微电流变化。

9.根据权利要求8所述的基于功能化核孔膜的ca50抗原电化学检测方法，其特征在于，所述电解液为0.5×pbs磷酸盐缓冲溶液标准溶液，所述电极为ag/agcl电极，所述电化学工作站施加的脉冲电压为-2～2v，每个脉冲电压持续时间5s。

技术总结
本发明公开了一种基于功能化核孔膜的CA50抗原电化学检测方法，使核孔膜孔道内壁共聚耦合的抗CA50单克隆抗体(C‑50)与CA50抗原结合，通过电化学工作站检测通过该核孔膜孔通道的微电流变化实现对CA50抗原的检测。本发明的制备方法反应温和、过程易控、操作简便、成本低，具有灵敏度高、快速、特异性高和操作简便的特点，对肿瘤的诊断、监测以及良、恶性肿瘤的早期鉴别有着十分重要的理论和实际意义。

技术研发人员：阎尔坤,张学斌,张文杰,白红升,邓德文
受保护的技术使用者：天津市协和医药科技集团有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15