一种测定乳糖-N-新四糖及其美拉德反应产物的检测方法

本发明涉及分析化学，尤其涉及一种利用离子色谱测定婴幼儿配方奶粉中乳糖-n-新四糖的检测方法。

背景技术：

1、母乳寡糖(human milk oligosaccharides，hmos)是成熟母乳中含量第三多的固体成分，作为婴儿的重要益生元，其中，乳糖-n-新四糖通过选择性刺激双歧杆菌等有益微生物，来塑造肠道微生物群。在婴儿配方奶粉150多年的发展历程中，其功能逐渐从基础营养发展到功能营养，成分和结构也越来越接近真正的母乳。2016年3月11日，欧盟批准乳糖-n-新四糖作为新食品成分使用，我国也于2022年10月公开征求乳糖-n-新四糖作为食品营养强化剂添加的意见，一种基于婴幼儿配方奶粉的、灵敏度高、抗干扰能力强的检测乳糖-n-新四糖(lnnt)及其美拉德反应产物含量的检测方法亟待开发。

技术实现思路

1、现有技术暂无应用于在婴幼儿配方奶粉基质中检测乳糖-n-新四糖及其美拉德反应产物含量的灵敏度高、抗干扰效果好的检测方法。

2、发明利用离子色谱检测婴幼儿配方奶粉中乳糖-n-新四糖及其美拉德反应产物的含量，即实现了在婴幼儿配方奶粉的复杂基质中检测乳糖-n-新四糖及其美拉德反应产物的含量，能够用于准确检验营养强化的婴幼儿配方奶粉中乳糖-n-新四糖的添加量是否达到或超出相应标准。

3、为了实现上述目的，本发明的具体的技术方案为：一种利用离子色谱测定婴幼儿配方奶粉中乳糖-n-新四糖及其美拉德反应产物的检测方法，所述方法包括以下步骤：

4、(1)配制标准储备液：称取lnnt、lnnt衍生物的标准品，加水定容得到标准储备液，备用；

5、(2)配制标准工作液：移取标准储备液配置成不同浓度的标准工作液；

6、(3)利用离子色谱测定标准工作液中的lnnt、lnnt衍生物的含量并得到标准曲线，其中，离子色谱的色谱条件为：carbopactm pa1离子色谱柱(4mm×250mm)，carbopactm pa1保护柱(4mm×50mm)；柱温25℃；检测器温度25℃；流速1ml/min；进样量10μl；淋洗液为0min40％ a相+60％ b相，10-22min 100％ b相；其中，a相：超纯水；b相：90mmol/l氢氧化钠溶液。。

7、(4)对婴幼儿配方奶粉进行复溶、除蛋白、除脂肪、寡糖浓缩纯化的前处理，其中，处理方法为：婴幼儿配方奶粉与超纯水1:7.3混合复溶，4℃下12000r/min离心30min，弃去上层脂肪和下层蛋白，取中间层溶液与两倍体积无水乙醇混合，4℃下静置过夜后10000r/min离心15min，取上清液利用石墨化碳固相萃取柱纯化，并通过spe离子色谱预处理柱得到上样样品。

8、(5)按照步骤(4)的方法处理待测样品，按照步骤(3)的方法得到待测样品中lnnt的出峰面积，并代入步骤(3)得到的标准曲线中计算得到待测样品中lnnt的浓度。

9、在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，标准储备液放置于4℃密封保存。

10、在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中标准储备液的浓度优选为300mg/l。

11、在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述混合标准工作液的浓度为3～80mg/l的梯度浓度，优选为3mg/l、5mg/l、10mg/l、20mg/l、40mg/l、60mg/l、80mg/l。

12、在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述的标准曲线以lnnt的浓度为横坐标，出峰面积为纵坐标。

13、在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述的石墨化碳固相萃取柱的活化方式为：3ml乙腈、3ml超纯水。

14、在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述的石墨化碳固相萃取柱的清洗方式为：10ml超纯水。

15、本发明取得的有益效果：

16、(1)本发明利用离子色谱检测婴幼儿配方奶粉中乳糖-n-新四糖及其美拉德反应产物含量的方法，能够用于准确检验食品营养强化剂添加量是否合格或超标；

17、(2)本发明中lnnt仪器检出限为2.6mg/l、定量限为15.4mg/l。本发明对lnnt的回收率在95％-105％之间，具有良好的重现性。

技术特征：

1.一种利用离子色谱测定婴幼儿配方奶粉中乳糖-n-新四糖(lnnt)的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，标准储备液放置于4℃密封保存。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，标准储备液的浓度为300mg/l。

4.根据权利要求1～3任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述标准工作液的浓度为3～80mg/l的梯度浓度。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述标准工作液的浓度为3mg/l、5mg/l、10mg/l、20mg/l、40mg/l、60mg/l、80mg/l。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的标准曲线以乳糖-n-新四糖的浓度为横坐标，出峰面积为纵坐标。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的复溶前处理方法为：婴幼儿配方奶粉与超纯水1:7.3混合复溶。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的除蛋白、除脂肪前处理方法为：所述复溶后溶液于4℃下12000r/min离心30min，弃去上层脂肪和下层蛋白，取中间层溶液与两倍体积无水乙醇混合。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的寡糖浓缩纯化前处理方法为：4℃下10000r/min离心15min，取上清液利用石墨化碳固相萃取柱纯化，并通过spe离子色谱预处理柱得到上样样品。

10.根据权利要求1～9任一项所述的检测方法在食品领域中的应用。

技术总结
本发明涉及奶粉中母乳寡糖(Human Milk Oligosaccharides，HMOs)乳糖‑N‑新四糖(Lacto‑N‑Neotetraose，LNnT)及其美拉德反应产物检测领域，公开了一种使用离子色谱对婴幼儿配方奶粉中添加乳糖‑N‑新四糖含量及反应后衍生物的检测方法。具体的，公开了一种检测乳糖‑N‑新四糖及衍生物的方法，并且能够实现高灵敏度、简便地检测乳糖‑N‑新四糖及衍生物。本发明提供的检测方法具有较高的检测效率和灵敏度。

技术研发人员：张昊,刘美希
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13