一种快速检测食品中四氢大麻酚的方法与流程

本发明涉及免疫层析检测，尤其是涉及一种快速检测食品中四氢大麻酚的方法。

背景技术：

1、大麻(cannabis sativa l.)是桑科大麻属植物，一直是受国际禁毒公约管制的毒品。组成大麻的化学成份极其复杂，大麻素是大麻中特有的含有烷基和单萜分子的一类次生代谢产物，主要包括四氢大麻酚(thc)、大麻二酚等，thc是使人致幻成瘾的主要成分，是植物大麻中最具有精神活性的物质。近年来加拿大、美国等国家将毒品大麻合法化，thc等大麻成分被允许添加到食品中。含有大麻成分的涉毒食品通过跨境电商和行邮渠道流入我国的风险日益加剧。我国法律明确规定，大麻不得用于医用和食品。为杜绝含有大麻成分的食品流入国内，针对食品基质中使人致幻成瘾的主要大麻成分thc的检测尤为重要。

2、目前国内外大麻成分检测研究中，方法主要有：色谱检测技术、质谱法、光谱检测技术、免疫检测法。传统方法存在诸多缺点，操作步骤繁琐、仪器设备昂贵等，现场快速检测技术几乎空白。

3、目前国内尚无检测食品中大麻成分胶体金免疫层析法检测的标准方法。查阅文献可知，黄书铭等在《四氢大麻酚酸检测试纸条的研制》一文中建立了尿液中四氢大麻酚酸的检测技术。采用柠檬酸三钠法还原氯金酸制备胶体金。确立了制备四氢大麻酚酸检测试纸条的最佳条件:标记10μg/ml的抗四氢大麻酚酸单克隆抗体，将金标抗体按喷量2.0μl/cm喷涂在已处理的聚酯膜上，最后将四氢大麻酚酸-牛血清白蛋白结合物和羊抗鼠按0.5、1.0mg/ml包被在硝酸纤维素膜(nc膜)上，经过37℃烘箱干燥16h，组装制备四氢大麻酚酸检测试纸条。这种方法能在3～5min内快速检测出尿液中残留的最小浓度为50ng/ml的四氢大麻酚酸。又如中国发明专利cn101580544a公开了胶体金标记大麻、四氢大麻酚单抗免疫检测板，以及用该完全抗原制备的抗四氢大麻酚单克隆抗体，以及胶体金标记四氢大麻酚单抗免疫检测板，以用于检测药品或尿样等人体标本中的四氢大麻酚。该发明首先进行结构模拟计算，将thc进行活化，采用化学结构保护方法，在其苯环上引入一个活性基团-羧基(thc-羧基-klh)，使其具有活泼的化学性质。采用同源双功能氨基偶联剂将活化的thc与大分子klh蛋白偶联，这样就使thc成为完全抗原所具有的免疫原性。

4、但是现有方法只能适用于尿液基质，不适用于食品基质。

技术实现思路

1、为了弥补已有技术的缺陷，本发明提供一种快速检测食品中四氢大麻酚的方法。

2、本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：

3、一种快速检测食品中四氢大麻酚的方法，其包括步骤：

4、(1)对食品进行前处理：将食品加入甲醇和氯化钠，水浴超声，离心后取全部上清液，加入无水硫酸镁和氯化钠，振荡，离心后取上清液，水浴氮吹至近干，复溶；取复溶后液体进行低温离心，取上清液，过有机滤膜，获得待测样液；

5、(2)将前处理后的样液与四氢大麻酚抗体接触，并与四氢大麻酚抗原竞争性结合，检测是否形成抗原抗体复合物，若抗体与包被抗原形成抗原抗体复合物则食品中不存在四氢大麻酚。

6、所述食品为固态状食品时，步骤(1)中对食品进行前处理具体包括如下步骤：将固态食品进行均质，称取1g匀质样本，加入7ml甲醇和0.7g氯化钠，40℃水浴超声20min，4℃8000rpm/min离心5min后，取全部上清液，加入2.188g无水硫酸镁和0.506g氯化钠，振荡5-10min，4℃8000rpm/min离心5min后，取1.75ml上清液，40℃水浴氮吹至近干，0.5ml 30％甲醇pbs复溶，取复溶后液体4℃下8000rpm/min离心5min，取上清液，放置于-20℃冷冻20min，取出，过0.22μm有机滤膜，获得待测样液。

7、所述食品为液态状食品时，步骤(1)中对食品进行前处理具体包括如下步骤：吸取1ml均匀的液态食品至15ml离心管中，加入3ml甲醇，涡旋混匀，从中取出2ml，加入0.2g氯化钠，40℃水浴超声20min，4℃8000rpm/min离心5min后，取全部上清液，加入0.625g无水硫酸镁和0.145g氯化钠，振荡5-10min，4℃8000rpm/min离心5min后，取1ml上清液，40℃水浴氮吹至近干，0.5ml 30％甲醇pbs复溶；取复溶后液体4℃下8000rpm/min离心5min，取上清，过0.22μm有机滤膜，获得待测样液。

8、在本发明中，进一步的，步骤(2)将前处理后的样液与四氢大麻酚抗体接触，检测是否形成抗原抗体复合物是采用胶体金免疫层析检测试剂盒进行检测。

9、在本发明中，进一步的，所述胶体金免疫层析检测试剂盒包括包被有四氢大麻酚抗体的微孔板和检测试纸条。

10、在本发明中，进一步的，所述微孔板的制备过程包括制备金标抗体溶液和制备微孔板。

11、在本发明中，进一步的，所述制备金标抗体溶液包括以下步骤：分别移取1ml胶体金溶液，加入4、6、8、10、12μl 0.2mol/l k2co3后快速涡旋混匀，加入5μg四氢大麻酚抗体，静置15min；选择不变色的胶体金溶液，加入100ul10％ bsa，静置15min；11000rpm/min 4℃离心10min，弃上清，用100μl金复溶液复溶，得到金标抗体溶液。

12、在本发明中，进一步的，所述制备微孔板包括以下步骤：在96孔微孔板中，每孔分别加入金标抗体溶液5μl、10％海藻糖0.5μl、10％曲拉通tx-100 7μl，并将微孔板放入隔板温度为-45℃的冻干机中预冻2.5h，真空冷冻干燥18h后，即得包被金标抗体的96孔微孔板，将冻干后的微孔板放置于4℃干燥条件下保存备用。

13、在本发明中，进一步的，所述采用胶体金免疫层析检测试剂盒进行检测包括以下步骤：将胶体金免疫层析检测试剂盒的微孔板取出，设置样品孔，阴性对照孔，阳性对照孔；取200μl前处理后的样液，200μl30％甲醇pbs，200μl空白加标样液，分别加入至微孔中，移液枪吹打混匀，将试纸条插入孔内，5min后观察结果；当c线显色强于t线显色，则检测结果为阳性；当c线显色弱于t线显色，则检测结果为阴性。

14、在本发明中，进一步的，所述固态状食品为饼干；所述液态状食品为椰子水。

15、本发明具有如下有益效果：

16、本发明提供一种简便快速检测食品中违禁添加的四氢大麻酚的技术，建立不同食品中高效提取大麻成分的方法，建立食品中大麻成分样品前处理技术，结合大麻特定成分性质建立快速简便和节省有机溶剂的样品前处理方法，实现更高的提取和检测效率。建立食品中大麻成分胶体金检测体系：基于大麻成分抗原及抗体结合层析膜，构建胶体金免疫层析技术实现大麻成分现场快速检测，主要应用到现场检测，对更加具有时效性的食品样品实现即检，提升检测效率。

技术特征：

1.一种快速检测食品中四氢大麻酚的方法，其特征在于，包括步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中：

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将前处理后的样液与四氢大麻酚抗体接触，采用胶体金免疫层析检测试剂盒检测是否形成抗原抗体复合物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述胶体金免疫层析检测试剂盒包括包被有四氢大麻酚抗体的微孔板和检测试纸条。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述包被有四氢大麻酚抗体的微孔板由金标抗体溶液和微孔板制备得到。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述金标抗体溶液的制备步骤如下：分别移取1ml胶体金溶液，加入4、6、8、10、12μl 0.2mol/l k2co3后快速涡旋混匀，加入5μg四氢大麻酚抗体，静置15min；选择不变色的胶体金溶液，加入100μl 10％bsa，静置15min；11000rpm/min 4℃离心10min，弃上清，用100μl金复溶液复溶，得到金标抗体溶液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述微孔板的制备步骤如下：在96孔微孔板中，每孔分别加入金标抗体溶液5μl、10％海藻糖0.5μl、10％曲拉通tx-100 7μl，并将微孔板放入隔板温度为-45℃的冻干机中预冻2.5h，真空冷冻干燥18h后，即得包被金标抗体的96孔微孔板，将冻干后的微孔板放置于4℃干燥条件下保存备用。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述采用胶体金免疫层析检测试剂盒检测包括以下步骤：将胶体金免疫层析检测试剂盒的微孔板取出，设置样品孔，阴性对照孔，阳性对照孔；取200μl前处理后的样液，200μl 30％甲醇pbs，200μl空白加标样液，分别加入至微孔中，移液枪吹打混匀，将试纸条插入孔内，5min后观察结果；当c线显色强于t线显色，则检测结果为阳性；当c线显色弱于t线显色，则检测结果为阴性。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述固态状食品为饼干。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述液态状食品为椰子水。

技术总结
本发明公开了一种快速检测食品中四氢大麻酚的方法，包括步骤：(1)对食品进行前处理：将食品加入甲醇和氯化钠，水浴超声，离心后取全部上清液，加入无水硫酸镁和氯化钠，振荡，离心后取上清液，水浴氮吹至近干，复溶；取复溶后液体进行低温离心，取上清液，过有机滤膜，获得待测样液；(2)将前处理后的样液与四氢大麻酚抗体接触，并与四氢大麻酚抗原竞争性结合，检测是否形成抗原抗体复合物，若抗体与包被抗原形成抗原抗体复合物则食品中不存在四氢大麻酚。本发明提供一种简便快速检测食品中违禁添加的四氢大麻酚的技术，建立不同食品中高效提取大麻成分的方法，建立食品中大麻成分胶体金检测体系，实现大麻成分现场快速检测。

技术研发人员：涂晓波,张恒,王子琳,张佳瑜,易长青
受保护的技术使用者：深圳海关食品检验检疫技术中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13