一种发酵六神曲的质量评价方法与应用与流程

本发明属于中药质量评价领域，具体涉及一种发酵六神曲的质量评价方法与应用。

背景技术：

1、六神曲始载于唐《药性论》，由面粉（麦麸）、杏仁、赤小豆以及青蒿、苍耳、辣蓼汁或煎煮液混合均匀后发酵、切丁、干燥而成。截至2020年版《中国药典》尚未收录六神曲，但全国各省《中药饮片炮制规范》大都有收录，质量标准以外观性状为主，通过观察颜色、菌斑菌衣和折断面质地、纹孔和气味来辨别优劣，缺乏量化评价指标，导致产品质量差异较大，严重影响临床疗效。

2、目前，有关六神曲发酵机制、药效物质及质量评价等方面的研究不够深入。六神曲作为一味发酵类中药，不同发酵程度六神曲的物质基础不同，相应的药效品质也存有差异，因此，有效区分不同发酵程度六神曲是质量评价及控制的关键因素。对于发酵过程不易控制的传统发酵类中药，有必要结合现代技术，建立全面、有效的区分及评价方法，明确不同发酵程度成品间的差异，为发酵类中药的质量控制及临床疗效提供保证。

技术实现思路

1、针对现阶段并没有六神曲发酵品的质量评价方法，本申请基于lc-ms技术建立不同发酵时间六神曲多种化学成分含量方法，结合化学计量学对不同发酵时间六神曲进行区分并筛选不同发酵阶段六神曲的差异性标志物，以便相对全面、客观地对六神曲发酵过程中化学成分的变化情况进行初步探究，为后续六神曲发酵机制、质量控制及临床应用等研究提供参考。

2、本申请的技术方案为：

3、一种发酵六神曲的质量评价方法，包括以下步骤：采用lc-ms技术，测定得到不同发酵时间六神曲的化学成分含量；利用主成分分析对不同发酵时间六神曲进行分类和评价，再借助正交偏最小二乘-判别分析法筛选出不同发酵程度六神曲间差异性标志物，最后采用聚类热图分析对不同发酵时间六神曲进行区分；得到不同发酵程度六神曲的差异性标志物；

4、所述的不同发酵程度六神曲的差异性标志物为原儿茶酸、苦杏仁苷、金丝桃苷、东莨菪内酯、阿魏酸、异绿原酸b。

5、优选地，lc的条件为：hypersil gold c18色谱柱，以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱。

6、优选地，流动相a为0.1%甲酸水溶液：流动相b为乙腈溶液，梯度洗脱的条件为0~0.5 min，5% b；0.5~2.0 min，5~8% b；2.0~3.0 min，8%~20% b；3.0~5.0 min，20%~30% b；5.0~7.0 min，30%~40% b；7.0~9.0 min，40%~50% b；9.0~11.0 min，50%~60% b；11.0~13.0min, 60%~70% b；13.0~15.0 min，70%~80% b；15.0~15.1 min，5% b；流速为0.30 ml•min−1；柱温为30 ℃；进样量为3.0 μl。

7、优选地，mc的条件为：电喷雾离子源，选择负离子检测模式，喷雾电压正离子3.5kv、负离子3.1 kv，鞘气流速30 arb，辅助气流速10 arb，辅助气温度350 ℃，离子传输管温度320 ℃。

8、本发明的另一目的，上述发酵六神曲的质量评价方法的应用，用于不同发酵时间六神曲的鉴定与质量评价。

9、本申请采用lc-ms技术建立了不同发酵程度六神曲18个成分的含量测定方法。为了确保建立的含量测定可对不同发酵时间六神曲中的成分进行较全面地分析，参照六神曲各原料药所含主要成分选用对照品，对lc-ms色谱峰进行指认，并分别对9种提取溶剂（稀乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇、水）、2种提取方式（超声、回流）、3种流动相（乙腈-0.1%乙酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液）及多种不同梯度洗脱条件进行了优化。结果显示，可作为区分不同发酵时间六神曲的关键指标，为六神曲发酵工艺优化及质量标准建立提供参考。

10、本申请借助opls-da法对不同发酵时间六神曲的化学成分按vip值大小排序，筛选出6个差异性成分（vip值≥1）为原儿茶酸、苦杏仁苷、金丝桃苷、东莨菪内酯、阿魏酸、异绿原酸b。东莨菪内酯、异绿原酸b主要来源于青蒿，具有抗疟疾、抗肿瘤、抑菌杀虫、解热抗炎、免疫调节作用；金丝桃苷主要来源于辣蓼，具有抗菌、保护消化道、抗炎、抗病毒、抗氧化等作用；原儿茶酸、阿魏酸主要来源于苍耳草，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫、调节血糖等活性。苦杏仁苷主要来源于苦杏仁，是苦杏仁中含量最高的苷类物质，具有镇痛消炎、免疫调节、抗肿瘤的药理作用。原儿茶酸、苦杏仁苷、金丝桃苷、东莨菪内酯、阿魏酸、异绿原酸b进行聚类热图分析，分析结果与18种化学成分聚类热图分析结果一致，进一步证实了选择6种成分作为差异性标志物的合理性。因此，青蒿、辣蓼、苍耳草和苦杏仁等原料药是六神曲质量控制的关键。

11、在六神曲发酵前期和中期，没食子酸、香草酸、咖啡酸、异绿原酸b、木犀草素和芹菜素含量均呈逐渐升高趋势，可能与发酵前期植物本身存在的纤维素酶等具有降解植物细胞壁，促进活性成分的溶出有关。槲皮素含量升高，可能是部分微生物在发酵环境下产生降解槲皮苷和金丝桃苷的酶，使两者成分进行分解生成代谢产物槲皮素以供微生物自身生长需求。发酵后期，多数成分含量又呈下降趋势，可能与发酵后期微生物（丝状真菌、酵母菌等）生长代谢过程产生的β-葡萄糖苷酶和纤维素酶降解有关。研究表明微生物发酵会普遍出现酚酸呈先增加后减少再增加的趋势。但有关六神曲发酵过程中，微生物的种群、生长代谢特性及其对六神曲物质基础的转化机理均不明确，仍有待进一步深入研究。

技术特征：

1.一种发酵六神曲的质量评价方法，其特征在于，包括以下步骤：采用lc-ms技术，测定得到不同发酵时间六神曲的化学成分含量；利用主成分分析对不同发酵时间六神曲进行分类和评价，再借助正交偏最小二乘-判别分析法筛选出不同发酵程度六神曲间差异性标志物，最后采用聚类热图分析对不同发酵时间六神曲进行区分；得到不同发酵程度六神曲的差异性标志物；

2.根据权利要求1所述的发酵六神曲的质量评价方法，其特征在于，lc的条件为：hypersil gold c18色谱柱，以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱。

3.根据权利要求1或2所述的发酵六神曲的质量评价方法，其特征在于，流动相a为0.1%甲酸水溶液：流动相b为乙腈溶液，梯度洗脱的条件为0~0.5 min，5% b；0.5~2.0 min，5~8%b；2.0~3.0 min，8%~20% b；3.0~5.0 min，20%~30% b；5.0~7.0 min，30%~40% b；7.0~9.0min，40%~50% b；9.0~11.0 min，50%~60% b；11.0~13.0 min, 60%~70% b；13.0~15.0 min，70%~80% b；15.0~15.1 min，5% b；流速为0.30 ml•min−1；柱温为30 ℃；进样量为3.0 μl。

4.根据权利要求1或2所述的发酵六神曲的质量评价方法，其特征在于，mc的条件为：电喷雾离子源，选择负离子检测模式，喷雾电压正离子3.5 kv、负离子3.1 kv，鞘气流速30arb，辅助气流速10 arb，辅助气温度350 ℃，离子传输管温度320 ℃。

5.权利要求1-4任一所述的发酵六神曲的质量评价方法的应用，其特征在于，用于不同发酵时间六神曲的鉴定与质量评价。

技术总结
本发明属于中药质量评价领域，具体涉及一种发酵六神曲的质量评价方法与应用。基于LC‑MS技术建立不同发酵时间六神曲多种化学成分含量方法，结合化学计量学对不同发酵时间六神曲进行区分并筛选不同发酵阶段六神曲的差异性标志物，以便相对全面、客观地对六神曲发酵过程中化学成分的变化情况进行初步探究，为后续六神曲发酵机制、质量控制及临床应用等研究提供参考。

技术研发人员：徐男,刘秦鹏,张从凯,徐轶,赵霞,崔彦伟,时海燕
受保护的技术使用者：山东省中医药研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11