小龙虾胚胎染色体的制备方法

本发明属于动物细胞实验，提供了一种小龙虾胚胎染色体的制备方法。

背景技术：

1、小龙虾(procambarus clarkia)，学名克氏原螯虾，在分类上属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、爬行亚目、螯虾科、原螯虾属。该虾属于广温性虾类，适应力强，繁殖率高，食性杂，生长快，离水数小时也不会死亡。虾肉味细嫩，营养丰富，富含人体必需的8种氨基酸，而脂肪含量较低，并含较多的原肌球蛋白和副肌球蛋白。深受消费者喜爱，出口量也日渐增加，销售和收购价格不断上升，养殖前景和效益较好。目前市场上的小龙虾由于自繁自育、近亲交配等问题日益突出，导致小个头小龙虾越来越多，头大肉少等问题日益突出。为了进一步研究该虾的遗传育种以及品种改良，对小龙虾的染色体进行研究非常有必要。通过把小龙虾的染色体研究清楚，进而可以在染色体操作水平上改良小龙虾。

2、由于小龙虾(procambarus clarkii)的染色体形态较小、数目较多，以往制备小龙虾染色体的方法主要用杀虾取精巢或卵巢做染色体或者是杀虾取触角腺做体细胞染色体，需要杀掉大量的虾，而且染色体分裂相有杂质导致染色体数目形态不清晰，不利于染色体的组型和染色体的遗传分析。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种小龙虾胚胎染色体的制备方法，采用胚胎制备染色体，不要杀掉大量的虾，而且染色体分裂相干净，染色体数目形态清晰，有利于染色体的组型和染色体的遗传分析。

2、为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

3、一种小龙虾胚胎染色体的制备方法，包括如下步骤：

4、(1)前期处理：取无节幼体期的小龙虾胚胎，浸于秋水仙素溶液中，在恒温培养箱中培养，离心后弃上清，得到细胞团沉淀；

5、(2)低渗：去净秋水仙素溶液，进行低渗处理，移去低渗液；

6、(3)固定：将步骤(2)后得到的细胞团进行预固定、后固定；

7、(4)制片：取步骤(3)后固定得到的胚胎于离心管中，并加入链酶蛋白酶进行消化，再加入醋酸溶液进行软化，撕掉胚胎的受精膜，再捣碎使胚胎细胞解离分散，离心后倒去上层的液体，加入固定液后用吸管吹打均匀，得到细胞悬液；

8、(5)喷片：将预冷的载玻片倾斜放置，用滴管吸取步骤(4)得到的所述细胞悬液，垂直喷到载玻片上，在酒精灯外焰上烘烤后，置于空气中干燥；

9、(6)染色：用吉姆萨染液对步骤(5)得到的附着有染色体的载玻片进行染色；

10、(7)镜检：在显微镜下进行观察和拍照。

11、上述的制备方法，优选的，在步骤(1)中，所述秋水仙素溶液的浓度为500mg/ml。

12、优选的，在步骤(1)中，所述恒温培养箱的温度为22-25℃，培育时间为3-4h；所述离心的转速为1000-1200r/min，时间为5-10min。

13、优选的，在步骤(2)中，所述低渗处理是用0.75％ kcl于37℃低渗处理20-30min。

14、优选的，在步骤(3)中，所述预固定、后固定是将移去低渗液后得到的细胞加入预冷到4℃的卡诺氏固定液中进行预固定1.5-3h，中间更换预固定液2次，再于预冷至4℃的后固定液中进行后固定。

15、更优选的，所述卡诺氏固定液由甲醇和冰醋酸按体积比3∶1混合得到，所述后固定液由甲醇和冰醋酸按体积比1∶1混合得到。

16、优选的，在步骤(4)中，所述链酶蛋白酶的浓度为2mg/ml，消化时间为20min；所述醋酸的体积浓度为50-60％，软化时间为15-20min。

17、优选的，在步骤(4)中，所述离心的转速为1000-1200r/min，时间为5-10min；所述后固定液由甲醇和冰醋酸按体积比1∶1混合得到。

18、优选的，在步骤(5)中，所述烘烤的时间为2-3s。

19、优选的，在步骤(6)中，所述吉姆萨染液的配置方法如下：称取0.5g的giemsa颗粒放入研钵，加入少许的甘油，研碎giemsa颗粒，再加入甘油使其总量为33ml，将其混匀得到混合液；将所述混合液于60℃水浴加热90min，加入33ml甲醇混匀，趁热过滤入棕色的玻璃瓶中，置于阴凉干燥处熟化至少半个月，用磷酸缓冲液按9∶1的体积比稀释后配制后使用。通过该方法得到的染色浓度均匀，基本上无染色大颗粒。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

21、本发明首次采用无节幼体期的小龙虾胚胎制备染色体，克服了取样数量的限制，同时不用解剖亲本虾，而且染色体分裂相干净，分裂相数目较多，染色体数目形态清晰，有利于染色体的组型和染色体的遗传分析；操作简单，制作周期短，成本低廉。

技术特征：

1.一种小龙虾胚胎染色体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述秋水仙素溶液的浓度为500mg/ml。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述恒温培养箱的温度为22-25℃，培育时间为3-4h；所述离心的转速为1000-1100r/min，时间为5-10min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述低渗处理是用0.75％kcl于37℃低渗处理20-30min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述预固定、后固定是将移去低渗液后得到的细胞加入预冷到4℃的卡诺氏固定液中进行预固定1.5-3h，中间更换卡诺氏固定液2次，再于预冷至4℃的后固定液中进行后固定。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述卡诺氏固定液由甲醇和冰醋酸按体积比3∶1混合得到，所述后固定液由甲醇和冰醋酸按体积比1∶1混合得到。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述链酶蛋白酶的浓度为2mg/ml，消化时间为20min；所述醋酸的体积浓度为50-60％，软化时间为15-20min。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述离心的转速为1000-1100r/min，时间为5-10min；所述固定液由甲醇和冰醋酸按体积比1∶1混合得到。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述烘烤的时间为2-3s。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤(6)中，所述吉姆萨染色液的配置方法如下：称取0.5g的giemsa颗粒放入研钵，加入少许的甘油，研碎giemsa颗粒，再加入甘油使其总量为33ml，将其混匀得到混合液；将所述混合液于60℃水浴加热90min，加入33ml甲醇混匀，趁热过滤入棕色的玻璃瓶中，置于阴凉干燥处熟化至少半个月，用磷酸缓冲液按9∶1的体积比稀释后配制后使用。

技术总结
本发明属于动物细胞学实验技术领域，具体公开了一种小龙虾胚胎染色体的制备方法，包括如下步骤：取无节幼体期的小龙虾胚胎，浸于秋水仙素溶液中，在恒温培养箱中培养，离心后弃上清，得到细胞团沉淀；再经过低渗、固定、制片、喷片、染色、镜检，即得到小龙虾胚胎染色体。本发明首次采用无节幼体期的小龙虾胚胎制备染色体，克服了取样数量的限制，同时不用解剖亲本虾，而且染色体分裂相干净，分裂相数目较多，染色体数目形态清晰，有利于染色体的组型和染色体的遗传分析；操作简单，制作周期短，成本低廉。最终，通过该方法能获得小龙虾清晰的体细胞染色体数为188条。

技术研发人员：刘少军,王余德,刘武霞,覃钦博,罗凯坤,王冬武,田欣
受保护的技术使用者：湖南师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14