高效液相色谱法检测甲氨蝶呤中间体及其对映异构体的方法与流程

本发明涉及分析检测领域，涉及高效液相色谱法检测甲氨蝶呤中间体及其对映异构体的方法，具体涉及测定(s)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸或其盐中所含r型异构体或r型异构体盐的检测方法。

背景技术：

1、甲氨蝶呤(methotrexate，mtx)是一种叶酸还原酶抑制剂，为抗叶酸类抗肿瘤药，主要通过对二氢叶酸还原酶的抑制达到阻碍肿瘤细胞dna的合成，从而抑制肿瘤细胞的生长与繁殖。其选择性地作用于s期，属于细胞周期特异性药物。临床上在急性白血病(尤其是急性淋巴细胞性白血病)、绒毛膜上皮癌及恶性葡萄胎等方面治疗效果较好。对头颈部肿瘤、乳腺癌、肺癌及盆腔肿瘤均有一定疗效，也可与其他药物联合治疗burkitts淋巴瘤，晚期淋巴肉瘤(ⅲ和ⅳ期，peter氏阶段系统)和晚期蕈样真菌病。甲氨蝶呤结构式为：

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3、现有技术公开的甲氨蝶呤合成方法中，通常采用(s)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸二钠(简称m3)作为甲氨蝶呤合成过程中的关键手性中间体，其是由对甲氨基苯甲酰谷氨酸二乙酯合成而来，分子式c13h14n2na2o5，分子量324.24，性状为白色至浅黄色粉末。其结构式为：

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5、该中间体的对映异构体为(r)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸二钠(简称m3-a)，分子式c13h14n2na2o5，分子量324.24，性状为白色结晶颗粒。其结构式为：

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7、在甲氨蝶呤后续工艺步骤中，该r型异构体杂质会进一步转化为甲氨蝶呤异构体杂质(简称杂质f)，其结构式为：

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9、由于终产物甲氨蝶呤的纯化工艺对甲氨蝶呤异构体杂质f无明显的清除效果，因此需要在中间体的制备过程阶段对该中间体的r异构体杂质进行检测控制，将其含量控制在非常低的水平，从而确保终产品中相应杂质含量符合质量要求。

10、经检索，目前没有涉及甲氨蝶呤中间体(s)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸对映异构体杂质色谱监控方法的文献报道，因此，需要开发一种可以在中间体工艺中准确地监控异构体杂质(r)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸含量的方法，以解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种能够快速、准确地检测甲氨蝶呤中间体(s)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸中对映异构体杂质(r)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸或其盐的含量的检测方法，从而能够在中间体工艺过程中有效地控制r型异构体杂质进一步转化为甲氨蝶呤异构体杂质f。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种高效液相色谱法测定(s)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸或其盐中所含r型异构体或r型异构体盐的检测方法，所述的高效液相色谱法采用直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂的色谱柱，流动相是流动相a正己烷与流动相b无水乙醇-乙腈-三氟乙酸体系的混合溶剂，其中流动相a与b按体积比为(78：22)～(85：15)进行等度洗脱；

3、进一步，本发明所述的色谱柱为dalcelchiralpakad-h，规格为250mm×4.6mm，5μm或效能相当的色谱柱；

4、进一步，本发明所述的流动相b中无水乙醇与乙腈体积比为(85：15)～(95：5)，三氟乙酸体积分数为0.05％～1％；

5、优选地，所述的流动相b中无水乙醇与乙腈体积比为90：10；

6、优选地，所述的三氟乙酸体积分数为0.1％～0.5％，更优选为0.3％；

7、进一步，流动相a与流动相b体积比为(78：22)～(80：20)，优选为80：20；

8、进一步，本发明所述的流动相流速为0.3～1.2ml/min，优选为0.7～0.8ml/min，更优选为0.7ml/min；

9、进一步，本发明所述的柱温为20～35℃，优选为20～25℃，更优选为25℃；

10、进一步，本发明所述的进样量5～20μl，优选为5μl；

11、进一步，本发明所述的检测波长为295±5nm，优选为295nm；

12、进一步，本发明所述的(s)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸的盐和/或所述r型异构体的盐为二钠盐；

13、进一步，本发明所述的检测为定性和/或定量检测；

14、进一步，本发明所述的定量检测是以面积归一化法计算(s)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸或其盐供试品溶液中所含r型异构体的含量；

15、根据本发明的一些具体实施方式，所述检测方法包括如下步骤：

16、(1)配制供试品溶液：取甲氨蝶呤中间体m3供试品适量，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含1.0mgm3的溶液；

17、(2)配制系统适用性溶液：分别取供试品m3和对映异构体杂质m3-a对照品，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含m31.0mg和m3-a对映异构体30μg的混合溶液。

18、(3)设置色谱条件：用直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂(dalcelchiralpakad-h，规格：250mm×4.6mm，5μm或效能相当的色谱柱)；以体积比为80:20正己烷与无水乙醇-乙腈-三氟乙酸(90：10：0.3)体系混合溶液为流动相进行等度洗脱；检测波长为295nm；柱温为25℃；流速0.7ml/min；

19、(4)测定：取空白溶液甲醇、步骤(1)和(2)的溶液各5μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图；系统适用性溶液色谱图中，出峰顺序依次为中间体m3与其对映异构体m3-a峰，其中，m3-a峰与相邻的峰分离度应大于1.5，且按面积归一化法计算供试品溶液中间体m3对映异构体含量。

20、本发明具有下述有益效果：

21、本发明提供了一种甲氨蝶呤中间体(s)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸对映异构体杂质的检测方法，能够实现对该中间体异构体杂质定性和定量检测，具有准确度高、灵敏度高、精密度高、专属性良好的优点。本发明提供的检测方法能够快速、准确地检测甲氨蝶呤中间体(s)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸中r型对映异构体的含量，从而能够在中间体工艺过程中有效地控制r型异构体杂质进一步转化为甲氨蝶呤异构体杂质f，对甲氨蝶呤合成工艺起到指导作用，具有非常重要的意义。

技术特征：

1.一种高效液相色谱法测定(s)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸或其盐中所含r型异构体或r型异构体盐的检测方法，其特征在于，所述的高效液相色谱法采用直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂的色谱柱，流动相是流动相a正己烷与流动相b无水乙醇-乙腈-三氟乙酸体系的混合溶剂，其中流动相a与b按体积比为(78：22)～(85：15)进行等度洗脱。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的色谱柱为dalcelchiralpakad-h，规格为250mm×4.6mm，5μm。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相b中无水乙醇与乙腈体积比为(85：15)～(95：5)，三氟乙酸体积分数为0.05％～1％。

4.根据权利要求1或3所述的检测方法，其特征在于，所述流动相b中无水乙醇与乙腈体积比为90：10；三氟乙酸体积分数为0.1％～0.5％，优选为0.3％。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相a与流动相b体积比为(78：22)～(80：20)，优选为80：20。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，流动相流速为0.3～1.2ml/min，优选为0.7～0.8ml/min，更优选为0.7ml/min。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，柱温为20～35℃，优选为20～25℃，更优选为25℃。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，进样量为5～20μl，优选为5μl；检测波长为295±5nm，优选为295nm。

9.根据权利要求1～8任意一项所述的检测方法，其特征在于：所述(s)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸的盐和/或所述r型异构体的盐为二钠盐。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述的检测为定性和/或定量检测；所述的定量检测是以面积归一化法计算(s)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸或其盐供试品溶液中所含r型异构体的含量。

技术总结
本发明提供了一种高效液相色谱法测定(S)‑2‑(4‑(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸或其盐中所含R型异构体或R型异构体盐的检测方法，该色谱条件是以直链淀粉‑三(3,5‑二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂的色谱柱，流动相是以流动相A正己烷与流动相B无水乙醇‑乙腈‑三氟乙酸体系的混合溶剂，其中流动相A与B按体积比为(78：22)～(85：15)进行等度洗脱。本发明提供的检测方法能够快速、准确地检测甲氨蝶呤中间体(S)‑2‑(4‑(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸对映异构体杂质的含量，从而能够在中间体工艺过程中有效地控制该R型异构体杂质进一步转化为甲氨蝶呤异构体杂质F，对甲氨蝶呤合成工艺起到指导作用，具有非常重要的意义。

技术研发人员：刘文武,付李,胡和平,苟文,徐秋平,丁兆
受保护的技术使用者：四川汇宇制药股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12