检测造血干细胞的组合物及其方法与流程

本发明涉及一种用于检测细胞的组合物，特别涉及一种应用于电化学方法，对造血干细胞实施定性和定量检测的组合物，提高检测的灵敏度。

背景技术：

1、适配体是可通过指数富集配体的系统进化技术产生的寡核苷酸序列或寡肽，能特异性地结合多种目标分子。自1990年适配体被第一次报道以来，基于适配体的生物技术得到了迅速发展，并广泛应用于生物传感、临床治疗和靶向给药等领域。与抗体相比，适配体不仅具有较强的结合亲和力和特异性外，还具有可在体外条件下生产、两端可以被不同的化学分子修饰便于检测、制备成本较低且具有高稳定性的优点。这些特征在治疗、诊断和分析应用中有很大的潜力。

2、干细胞在体内所有其他细胞中具有独特的自我更新能力和产生分化细胞的能力。造血干细胞(hsc)是最具特色的干细胞类型之一，它是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞具有重要指导意义。相关研究表明，大部分白血病，特别是急性髄系白血病(aml)以及慢性髄性白血病(cml)的发生，都直接或间接与造血干细胞异常相关。造血干细胞在实体肿瘤微环境调节中也有一定作用，更重要的是，造血干细胞移植广泛应用于血液系统疾病以及自身免疫疾病的临床治疗中。hsc的功能和潜在的治疗重要性吸引了这些细胞的深入研究。因此，建立一种高效灵敏的造血干细胞分析方法显得尤为重要。

技术实现思路

1、本发明的一个目的在于提供一种检测造血干细胞的组合物，实现电化学方法实施造血干细胞的检测。

2、本发明的另一个目的在于提供一种检测造血干细胞的组合物，以高效检测造血干细胞，提高检测灵敏度。

3、本发明的再一个目的在于提供一种检测造血干细胞的方法，以电化学方式实施造血干细胞的检测。

4、本发明的又一个目的在于提供一种检测造血干细胞的方法，实现造血干细胞的定量检测。

5、一种检测造血干细胞的组合物，包括：

6、造血干细胞结合肽功能化的磁珠，

7、crrna，

8、马来酰亚胺修饰的激活核酸链，和

9、亚甲基蓝修饰的信号核酸链。

10、本发明的检测造血干细胞的组合物，造血干细胞结合肽序列为：gggpfsstkte。

11、本发明的检测造血干细胞的组合物，crrna序列为：

12、5'-uaauuucuacuaaguguagauuaugauguggagauacucgguauaa-3'。

13、本发明的检测造血干细胞的组合物，信号核酸链的序列为：

14、5'-atgccgatccccaaaagtgtacacttaatcgaagcttt-mb-3'。

15、本发明的检测造血干细胞的组合物，激活核酸链的序列为：

16、5'-mi-ttataccgagtatctccacatcata-3'

17、本发明的检测造血干细胞的组合物，利用crispr/cas信号放大反应，通过温和还原反应将crispr/cas系统的激活核酸链标记到了造血干细胞的表面，通过标记链与crrna的互补结合，激活cas12a蛋白的反式切割活性，随机切割dna信号长链，释放末端修饰的亚甲基蓝(mb)。

18、切割产生的游离亚甲基蓝分子与葫芦[7]脲(cb[7])、金纳米颗粒(aunps)和聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)共同功能化的石墨电极孵育，能够被cb[7]的疏水空腔捕获，形成具有的稳定的主-客体配合物，产生电化学信号，通过测定功能化石墨电极表面富集的亚甲基蓝电化学信号，可以实现造血干细胞的(定量)检测。

19、将本发明提供的组合物用于以电化学方法实施造血干细胞的检测，提高信号标记效率和检测灵敏度。

20、一种检测造血干细胞的方法，包括：

21、将待测溶液与造血干细胞结合肽功能化的磁珠混合并于室温下孵育(如：2～3小时)；

22、然后，通过温和还原反应将crispr/cas系统的激活核酸链标记到了造血干细胞的表面，通过信号核酸链与crrna的互补结合，激活cas12a蛋白的反式切割活性，随机切割信号核酸链，释放末端修饰的亚甲基蓝；

23、产生的游离亚甲基蓝分子与葫芦[7]脲(cb[7])、金纳米颗粒(aunps)和聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)共同功能化的石墨电极孵育，能够被cb[7]的疏水空腔捕获，形成具有的稳定的主-客体配合物，产生电化学信号，通过测定功能化石墨电极表面富集的亚甲基蓝电化学信号，实现造血干细胞的检测。

24、另一种检测造血干细胞的方法，包括：

25、将待测溶液与造血干细胞结合肽功能化的磁珠混合并于室温下孵育(如：2～3小时)；

26、然后，加入马来酰亚胺修饰的激活核酸链(如：1～1.5μm，加入100～150μl)，在37℃±0.5℃下反应(如：30～60分钟)以进行信号标记后，洗涤两次；

27、接着，加入crrna(如：200～300nm)，亚甲基蓝标记的信号核酸链(如：600～800nm)和cas12a蛋白(如：200～300nm)，加入depc水最终溶液体积为100～150μl，于37℃±0.5℃下反应(如：10～15分钟)，并在65℃～70℃下加热(如：10～20分钟)以使酶失活，磁性分离获得上清液；

28、上清液于功能化石墨电极上室温孵育1～2个小时。最后，将修饰过的电极彻底清洗以进行电化学测量。测定方波伏安法(swv)时所采用的实验条件是：电位扫描范围0～-0.6v，势阶跃4mv，振幅25mv，频率15hz。

29、本发明技术方案实现的有益效果：

30、与传统的标记方法相比，温和还原反应介导的标记方法不依赖与细胞表面的特定蛋白，因而可以结合更多的细胞表面位点，提高信号标记效率和检测灵敏度。

31、造血干细胞结合肽修饰的磁珠富集分离细胞可以提高检测的抗干扰性，即使在复杂的血清环境中也具有很强的选择性，有助于在实际样本中检测分析。

32、crispr/cas12a系统对单链dna有非特异性切割活性，其在溶液中产生的信号放大效果明显，其核酸检测的灵敏度能达到pm级别，实现了细胞检测限为7个细胞/毫升。

技术特征：

1.一种检测造血干细胞的组合物，其特征在于包括：

2.根据权利要求1所述的检测造血干细胞的组合物，其特征在于还包括cas12a蛋白。

3.根据权利要求1所述的检测造血干细胞的组合物，其特征在于所述的造血干细胞结合肽序列为：gggpfsstkte。

4.根据权利要求1所述的检测造血干细胞的组合物，其特征在于所述的crrna序列为：

5.根据权利要求1所述的检测造血干细胞的组合物，其特征在于所述的信号核酸链的序列为：

6.根据权利要求1所述的检测造血干细胞的组合物，其特征在于所述的激活核酸链的序列为：

7.根据权利要求1所述的检测造血干细胞的组合物用于电化学方法检测造血干细胞，通过温和还原反应将crispr/cas系统的激活核酸链标记到了造血干细胞的表面，通过标记核酸链与crrna的互补结合，激活cas12a蛋白的反式切割活性，随机切割dna信号长链，释放末端修饰的亚甲基蓝，产生的游离亚甲基蓝分子与葫芦[7]脲、金纳米颗粒和聚二烯丙基二甲基氯化铵共同功能化的石墨电极孵育，能够被葫芦[7]脲的疏水空腔捕获，形成具有的稳定的主-客体配合物，产生电化学信号，通过测定功能化石墨电极表面富集的亚甲基蓝电化学信号，实现造血干细胞的检测。

8.一种检测造血干细胞的方法，其特征在于包括：

9.根据权利要求8所述的检测造血干细胞标志物的方法，其特征在于所述的造血干细胞结合肽序列为：gggpfsstkte；

10.根据权利要求8所述的检测造血干细胞标志物的方法，其特征在于所述的电化学检测分析，以方波伏安法进行扫描，扫描范围从0v～-0.6v，振幅为25mv，电位阶跃为4mm，频率为15hz。

技术总结
一种检测造血干细胞的组合物，包括造血干细胞结合肽功能化的磁珠、crRNA、马来酰亚胺修饰的激活核酸链和亚甲基蓝修饰的信号核酸链。利用CRISPR/Cas信号放大反应，通过温和还原反应将CRISPR/Cas系统的激活核酸链标记到了造血干细胞的表面，通过标记链与crRNA的互补结合，激活Cas12a蛋白的反式切割活性，随机切割DNA信号长链，释放末端修饰的亚甲基蓝(MB)。MB分子与CB[7]、AuNPs和PDDA共同功能化的石墨电极孵育，能够被CB[7]的疏水空腔捕获，形成具有的稳定的主‑客体配合物，产生电化学信号，通过测定功能化石墨电极表面富集的亚甲基蓝电化学信号，可以实现造血干细胞的检测。

技术研发人员：章毅,伍婷,赵婧,胡肖希,陈亮
受保护的技术使用者：中国干细胞集团上海生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15