一种有机磷农药的比率型荧光检测方法

本发明提供一种有机磷农药(ops)的比率型荧光检测方法，属于食品安全检测。

背景技术：

1、有机磷农药(ops)被广泛应用于蔬菜中的害虫防治，然而，不合理的使用ops会导致蔬菜中的ops过量残留，而这些残留通过食物链蓄集会诱发人体中毒。

2、因此，开发一种快速灵敏的检测方法来分析蔬菜中残留的ops是至关重要的，目前，液相色谱-质谱法(lc-ms)、高效液相色谱法(hplc)和酶联免疫吸附法(elisa)等方法应用较多，但这些方法存在一些局限性，如仪器价格昂贵、对操作员技术要求高以及样品预处理过程复杂，面对日益增长的样品检测需求，需要开发一种更快、更简单、更高效的ops检测方法。

技术实现思路

1、发明的目的在于建立一种快速、简单、高效的检测技术检测蔬菜中的ops残留。

2、其技术方案为：乙酰胆碱(ach)被乙酰胆碱酯酶(ache)转化为胆碱，而胆碱又被胆碱氧化酶(chox)氧化为过氧化氢(h2o2)，然而，ops可以使ache活性部位的丝氨酸残基磷酸化，导致其被抑制，从而抑制h2o2的产生。

3、h2o2可以通过芬顿反应分解为羟基自由基(·oh)，因此，在反应体系中检测到·oh，就可以进行h2o2的测量。谷胱甘肽(gsh)常被生物体用作消除·oh的抗氧化剂，以谷胱甘肽为模板合成的金纳米团簇(gsh-auncs)发出橙色荧光，·oh对gsh的损伤可导致gsh-auncs的荧光猝灭。

4、四苯基乙烯(tpe)能够产生聚集诱导发光(aie)，由于tpe聚集过程中苯环的分子内旋转受到抑制，从而限制了激发态的非辐射跃迁，从而处于激发态的分子只能通过辐射跃迁恢复到基态，这大大增加了荧光强度。利用手机应用程序“rgb color picker”对不同浓度的ops对应的荧光颜色进行rgb识别，实现了ops的视觉检测，基于已经建立的rgb标准曲线，开发了微信小程序来快速定量ops的浓度。

5、所述的一种检测蔬菜中ops残留的荧光传感器的工作原理(图1)，其特征在于：不存在ops时，ache催化ach产生胆碱，进而在chox催化下，生成h2o2。h2o2将二茂铁修饰的四苯基乙烯(tpe-fc)氧化成其氧化态tpe-fc+。tpe-fc+具有更大的聚集倾向，产生aie，青色荧光发生增强。同时，二茂铁氧化过程产生·oh，破坏了gsh-auncs，导致橙色荧光降低。ops存在会抑制这一过程，随着浓度的增加，青色荧光减弱，橙色荧光增强，从而实现ops的可视化检测。此外，使用智能手机对红色(r)、绿色(g)和蓝色(b)数值进行识别，建立了rgb标准曲线并开发了微信小程序用于ops残留浓度的快速检测。

6、为达到以上目的，采取以下技术方案实现：gsh-auncs的合成方法为3ml 100mmgsh与20ml 10mm haucl4混合，然后加入27ml超纯水。将混合物在室温下剧烈搅拌至无色，然后在70℃水浴中加热24h，用3kd超滤管超滤1h，纯化3次，复溶在超纯水中，最终的溶液保存在4℃备用。tpe-fc的合成方法为，在一个三口烧瓶中装6.7g溴三苯乙烯，4.5g 4-甲酰苯硼酸，0.64g四丁基溴化铵，80ml甲苯和25ml 2m碳酸钾溶液，搅拌30min，加入0.02g四(三苯基膦)钯，在氮气环境下反应24h，然后将得到的溶液与水混合，并用乙酸乙酯萃取三次，用无水硫酸钠对有机层进行干燥，溶剂通过减压旋转蒸发去除，最终产物tpe-cho用石油醚/二氯甲烷(10:1)柱层析纯化。将200μl水合肼(80％)溶于20ml乙醇，加入烧瓶中。将0.48gtpe-cho溶解于35ml乙醇中，超声搅拌使其完全溶解，缓慢滴加到烧瓶中，所得混合物在氮气下回流3小时，制得tpe-nh2。超声搅拌将0.204g二茂铁甲醛溶于50ml乙醇中。将tpe-nh2(0.324g)溶于50ml乙醇中，超声搅拌至完全溶解，然后缓慢滴加到二茂铁甲醛溶液中，将混合物在氮气下回流6小时，然后将所得溶液洗涤3次，过滤，结晶。

7、为达到以上目的，采取以下技术方案实现：荧光分析选择敌百虫(tri)作为实验的ops，在ph＝7.5的pb缓冲液中，分别加入300μl ache(1.0u/ml)和300μl不同浓度的tri，37℃孵育15min，再加入150μl chox(1.0u/ml)和20μl atchcl(150mm)孵育35min，将500μl所得溶液与1.2ml tpe-fc(1mm)和100μl纯化gsh-auncs混合物混合，在350nm激发波长和5nm狭缝处记录荧光信号。

8、所述传感器的制备工艺如下：本研究中使用的卷心菜和花椰菜都是从当地超市购买的，使用了一种改进的样品处理方法，5g蔬菜用超纯水洗净，晾干后，样品完全粉碎，加入20ml pb(ph＝7.5)。然后将混合物在95℃水浴中加热10min，以消除任何来自内在酶的干扰，将得到的溶液离心，收集上清液，用0.22μm过滤膜过滤，滤液中加入不同浓度的tri，与ache 37℃孵育15min，与chox、atchcl复配孵育35min，随后，将tpe-fc和gsh-auncs加入混合物中，检测荧光信号。

技术特征：

1.一种有机磷农药（ops）的比率型荧光检测方法，其特征在于：构建了一种基于二茂铁修饰的四苯基乙烯（tpe-fc）和谷胱甘肽合成的金纳米团簇（gsh-auncs）的比率型荧光传感器，并使用智能手机对荧光颜色的红色（r）、绿色（g）和蓝色（b）数值进行识别，建立rgb标准曲线并开发了微信小程序用于ops残留浓度的快速检测。

2.如权利要求1所述的一种ops的比率型荧光检测方法，其特征在于：当tpe-fc被乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶催化生成的过氧化氢氧化成tpe-fc+时，青色荧光被增强，•oh将gsh-auncs的合成模板还原型谷胱甘肽（gsh）氧化为氧化型谷胱甘肽（gssg），导致gsh-auncs的橙色荧光减弱，两者形成比率变化，而ops会抑制该过程的发生。

3.如权利要求1所述的一种ops的比率型荧光检测方法，其特征在于：tpe-fc和gsh-auncs构成双信号比率型荧光传感器，暴露于紫外光时荧光颜色会产生比率变化，而随着ops的浓度增大，荧光由青色向橙色变化，从而实现ops的视觉检测。

4. 如权利要求1所述的一种ops的比率型荧光检测方法，其特征在于：传感器对ops检测的线性范围为10-2000 ng/ml，检出限为2.05 ng/ml。此外，使用智能手机对r、g和b数值进行识别，并且开发了微信小程序，实现了蔬菜中ops残留浓度的快速定量分析。

技术总结
本发明提供了一种检测蔬菜中有机磷农药（OPs）残留的荧光传感器制备方法，属于食品安全检测领域。不存在OPs时，乙酰胆碱酯酶（AChE）催化乙酰胆碱（ACh）产生胆碱，进而在胆碱氧化酶（ChOx）催化下，生成过氧化氢（H2O2）。H2O2将二茂铁修饰的四苯基乙烯（TPE‑Fc）氧化成其氧化态TPE‑Fc+。TPE‑Fc+具有更大的聚集倾向，产生聚集诱导发光（AIE），青色荧光发生增强。同时，二茂铁氧化过程产生羟基自由基（•OH），破坏了谷胱甘肽为模板合成的金纳米团簇（GSH‑AuNCs），导致GSH‑AuNCs的橙色荧光降低。OPs存在会抑制这一过程，随着浓度的增加，青色荧光减弱，橙色荧光增强，从而实现OPs的可视化检测。此外，使用智能手机对红色（R）、绿色（G）和蓝色（B）数值进行识别，建立了RGB标准曲线并开发了微信小程序用于OPs残留浓度的快速检测，结果准确可靠。

技术研发人员：李发兰,王晓阳,于化杰,李秋红,田宇航,孙霞,郭业民,杨青青,张妍妍
受保护的技术使用者：山东理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15