一种用于诊断IgG4相关性疾病检测试剂盒及其应用

本发明涉及试剂盒领域；尤其涉及一种用于诊断igg4相关性疾病检测试剂盒及其应用。

背景技术：

1、igg4相关性疾病(igg4-rd)是一种罕见的系统性疾病，以慢性炎症及纤维化为特征，隐匿进展，严重可危及生命。igg4-rd常累及全身多个器官，组织呈现类瘤样改变，由于缺少特异的生物标志物，导致igg4-rd误诊误治时有发生。受累组织的特征性病理改变是igg4-rd诊断的关键指标。最新的igg4-rd诊治指南将受累组织的病理特征在诊断中的权重大大增加，因此受累组织活检成为诊断疾病重要指标。

2、组织活检是诊断疾病的金标准，在igg4-rd的诊断中占有很大权重。免疫组化技术作为组织染色的经典方法在病理诊断中广泛应用，也是目前公认的标准方法。免疫组化方法需要在连续切片上分别进行igg4、igg免疫组化染色，并且在显微镜下人工计数得出结果。现有方法存在以下问题：1.如何在连续切片上寻找同一视野？两张连续3um的石蜡切片理论上是可以找到相同或相似的视野，但这对制片技术有一定的要求，这其中包括切片、捞片，染色等一系列的质控环节和影响因素，增加了找到相同视野的难度，增加了病理诊断的工作量；2.如何准确的得到igg4及igg的高倍视野下个数？目前对igg4和igg的计数多由病理医生在镜下数数得到，这样就存在较多的主观因素的成分，不同的医生可能会得到相似但不同的结果，而如果这种差异发生在igg4/igg的临界值就会对诊断结果产生的影响。

3、igg4-rd受累组织的主要病理特征包括席纹状纤维化，闭塞性静脉炎和igg4高倍镜下计数及igg4/igg比例等指标，其中igg4高倍镜下计数及igg4/igg比例在疾病诊断中特异性最高。因此，得到受累组织中准确的igg4高倍镜下计数及igg4/igg比例是诊断疾病的关键。然而目前使用的免疫组化方法需要在连续切片上分别进行igg4、igg免疫组化染色，并且在目镜下人工计数得出结果，这种方法对制片技术要求高且依赖于医生的主观判断。解决诊断中的igg4、igg染色，并在同一视野下计算准确的igg4/igg比例是提高igg4-rd早期诊断率的关键，因此，本发明检测试剂盒应用对于igg4-rd的诊断意义重大。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供了一种用于诊断igg4相关性疾病检测试剂盒及其应用。本发明通过使用多标记免疫组化染色技术对igg4相关性疾病(igg4-rd)受累组织中的关键指标：igg4/igg的比例进行了量化算法，并于现有的传统免疫组化技术进行比较，建立了稳定可靠的诊断手段；在同一视野显示两种指标并能精确计数的方法对诊断igg4-rd至关重要。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、本发明涉及一种用于诊断igg4相关性疾病检测试剂盒，该试剂盒包括：抗体的染料配对：igg4抗体-ppd 520、igg抗体-ppd 650和cd38抗体-ppd 570，抗体稀释液，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/鼠通用二抗，信号放大液，核染料，非免疫动物血清，封片剂，抗原修复液和洗液。

4、优选地，所述抗原修复液的配方为：1l所述抗原修复液中：1.21gtris，0.29gedta，0.5ml吐温溶于1l灭菌去离子水中，调ph至9.0。

5、优选地，所述洗液的配方为：1l所述洗液中：15.76g tris-hcl，9.0g nacl溶于1l灭菌去离子水中。

6、优选地，所述抗体的修复条件：在输出功率为700w的微波炉处于低火-解冻中间档3min，加热至沸腾，放入切片，调高火档15分钟，抗原修复。

7、优选地，所述试剂盒的染色具体步骤为：

8、步骤1，单抗igg4染色：石蜡切片进行常规脱蜡至水步骤，抗原微波热修复，非免疫动物血清室温封闭10min，igg4稀释比例为1：100，4℃过夜孵育，洗液3min，3次，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/鼠通用二抗室温孵育，10min，洗液3min，3次，ppd 520染色剂1：100稀释，室温孵育，10min，洗液3min，3次，微波洗脱多余染色剂，得igg4抗体-ppd 520；

9、步骤2，单抗igg染色：非免疫动物血清室温封闭10min，igg稀释比例为1：100，37℃孵育1h，洗液3min，3次，二抗室温孵育，10min，洗液3min，3次，ppd 650染色剂1：100稀释，室温孵育，10min，洗液3min，3次，微波洗脱多余染色，得igg抗体-ppd 650；

10、步骤3，单抗cd38染色：非免疫动物血清室温封闭10min，cd38稀释比例为1：100，37℃孵育1h，洗液3min，3次，二抗室温孵育，10min，洗液3min，3次，ppd 570染色剂1：100稀释，室温孵育，10min，洗液3min，3次，微波洗脱多余染色，得cd38抗体-ppd 570；

11、步骤4，染核：在染完三个单抗igg4抗体-ppd 520、igg抗体-ppd 650、cd38抗体-ppd 570的切片上加核染料dapi，1：100稀释，室温孵育10min，洗液3min，3次，封片剂封片，多光谱显微镜观察。

12、本发明具有以下优点：

13、本发明所涉及的用于igg4相关性疾病病理诊断的多标免疫组化检测试剂盒，该试剂盒可运用患者的组织切片多标记免疫染色及光谱成像技术，实现了在一张切片上检测igg4-igg-cd38三种分子标记，并通过软件算法计算出igg4/igg比例及igg4/cd38比例，最终实现了提高诊断准确率的目的，并易于在临床应用。

技术特征：

1.一种用于诊断igg4相关性疾病检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：抗体的染料配对：igg4抗体-ppd520、igg抗体-ppd650和cd38抗体-ppd570，抗体稀释液，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/鼠通用二抗，信号放大液，核染料，非免疫动物血清，封片剂，抗原修复液和洗液。

2.如权利要求1所述的用于诊断igg4相关性疾病检测试剂盒，其特征在于，所述抗原修复液的配方为：1l所述抗原修复液中：1.21gtris，0.29gedta，0.5ml吐温溶于1l灭菌去离子水中，调ph至9.0。

3.如权利要求1所述的用于诊断igg4相关性疾病检测试剂盒，其特征在于，所述洗液的配方为：1l所述洗液中：15.76gtris-hcl，9.0gnacl溶于1l灭菌去离子水中。

4.如权利要求1所述的用于诊断igg4相关性疾病检测试剂盒，其特征在于，所述抗体的修复条件：在输出功率为700w的微波炉处于低火-解冻中间档3min，加热至沸腾，放入切片，调高火档15分钟，抗原修复。

5.如权利要求1所述的用于诊断igg4相关性疾病检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的染色具体步骤为：

6.一种如权利要求1所述的用于诊断igg4相关性疾病检测试剂盒的应用，其特征在于，该试剂盒在临床中的应用。

技术总结
本发明提供了一种用于诊断IgG4相关性疾病检测试剂盒及其应用；包括：抗体的染料配对：IgG4抗体‑PPD520、IgG抗体‑PPD650和CD38抗体‑PPD570，抗体稀释液，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/鼠通用二抗，信号放大液，核染料，非免疫动物血清，封片剂，抗原修复液和洗液。本发明有效成分将诊断IgG4‑RD的关键指标IgG4、IgG、CD38在一张切片上进行显示，并通过采图和算法进行数据提取和计算，能够客观快捷的显示IgG4+细胞计数、IgG+细胞计数并计算出IgG4/IgG比例、IgG4/CD38比例。本发明具有可靠的染色结果，并且数据客观准确，克服了传统诊断中的因复杂性与主观因素影响数据准确性的技术问题。

技术研发人员：朱平,张葵,郑朝晖,符向辉
受保护的技术使用者：中国人民解放军空军军医大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15