一种利用脂肪酸标志物鉴别中药海藻的方法

本发明涉及一种中药材的鉴别方法，特别涉及一种利用脂肪酸作为标志物鉴别中药海藻的方法。

背景技术：

1、中药海藻始载于《神农本草经》，性寒、味咸，功能软坚散结，消痰利水，常用于治疗高血脂、冠心病、肿瘤、乳腺增生、淋巴结核等。据《中国药典》一部，中药海藻为褐藻门马尾藻属海蒿子sargassum pallidum(turn.)c.ag或羊栖菜s.fusiforme(harv.)setch的干燥藻体。其中，海蒿子因野生资源量逐年减少，现市场很少见到该种药材。而羊栖菜则是中药海藻的古今传统药用品种，近年来养殖产量持续位居我国海水藻类第五位，是目前主要的中药海藻品种。

2、羊栖菜和海蒿子所在的马尾藻属在我国沿海生物多样性丰富，这也导致了海藻药材品种较为混乱，常见伪品有同属的鼠尾藻、铜藻、海黍子等。马尾藻属物种鉴定一直是藻类分类学研究的难点，因藻体形态和器官组织结构相近、叶和气囊表型随环境变化，生理特征趋同等特点，使得传统的性状鉴别、显微鉴别等方法存在较大鉴定难度，非常依赖鉴别人的经验，较难鉴定到该属具体物种，导致中药海藻目前尚缺乏简单有效的鉴别方法。

3、脂质在生物学过程中发挥着广泛而重要的作用。马尾藻属的脂质主要包括脂肪酸及其衍生脂(磷脂、糖脂、甘油酯等)、甾醇以及类胡萝卜素类等，具有抗氧化、降血脂、抗炎免疫等生物活性。其中，脂肪酸是人体营养和健康所必需成分，是重要的活性成分。目前已有脂肪酸作为大型海藻分类标记物的相关报道，其中多数通过单一或多个脂肪酸作为分类标志物，但该类标志物更适用于脂肪酸特征差异较大的藻类门、目等分类水平的鉴别。而脂肪酸比值从生合成特征方面能够更好地反映物种间的代谢调控差异，可以更好地用于化学分类学研究，如比值亚油酸/亚麻酸(c18:2n-6/c18:3n-3)常被用于油料掺伪验证。

4、而与高等植物相比，目前仅有少量研究通过脂肪酸比值在分类学门水平上进行藻类鉴别，如khotimchenko报道c20:5n-3/c20:4n-6和c18:1n-7/c18:1n-9比值可用于表征红藻和绿藻门的分类特征(khotimchenko s v,vaskovsky v e.distribution of c20polyenoic fatty acids in red macrophytic algae[j].botanica marina,1990,33(6):525-528.)(khotimchenko s v.fatty acids of green macrophytic algae from thesea of japan[j].phytochemistry,1993,32(5):1203-1207.)，尚缺少属水平鉴别的相关研究，也没有褐藻门的相关标志物。因此，以脂肪酸比值作为标志物，用于中药海藻及其同属易混马尾藻的鉴别具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种简便、快速、准确的利用脂肪酸标志物鉴别中药海藻(羊栖菜)的方法。

2、本发明目的通过以下技术方案实现：

3、一种利用脂肪酸标志物鉴别中药海藻的方法，其特征在于，通过测定c20:1n-9/c16:1n-7的比值来鉴别中药海藻；当c20:1n-9/c16:1n-7的比值范围在0.44～1.40之间时，即可判断为是中药海藻。

4、其中，c20:1n-9代表顺-11-二十碳烯酸(cis-11-eicosenoic acid，花生烯酸)，c16:1n-7代表顺-9-十六碳烯酸(cis-9-hexadecenoic acid，棕榈油酸)。

5、所述中药海藻指的是羊栖菜。

6、本发明具体的技术方案如下：

7、1)取海藻样品适量，加入二氯甲烷-甲醇进行提取，合并提取液，浓缩得总脂提取物；

8、2)取总脂提取物，经皂化、甲酯化后，再使用正己烷萃取有机层，得正己烷溶液；

9、3)将正己烷溶液注入气相色谱-质谱(gc-ms)联用仪，测定脂肪酸组成；

10、4)采用面积归一化法计算脂肪酸相对含量；

11、5)运用正交偏最小二乘判别分析的化学模式识别法筛选羊栖菜与同属其他马尾藻的差异脂肪酸；

12、6)结合脂肪酸生合成途径，以及差异脂肪酸筛选结果，确定c20:1n-9/c16:1n-7的比值范围为0.44～1.40时可用于区分羊栖菜与同属其他马尾藻；

13、7)对于未知样品计算c20:1n-9/c16:1n-7比值，当c20:1n-9/c16:1n-7的比值范围为0.44～1.40时，即可判断为中药海藻。

14、进一步的，步骤1)中的提取溶剂为二氯甲烷-甲醇(2:1，v/v)，提取方式为索氏回流提取。

15、步骤2)中，所述皂化为加入1m的氢氧化钾-甲醇溶液，反应温度为70℃，反应时间为10分钟；所述甲酯化试剂为1m的盐酸-甲醇溶液，进行甲酯化衍生，反应时间为10分钟。

16、步骤3)中，气相色谱分析条件为使用omegawax 250毛细管色谱柱(30m×0.25mm,0.25μm)，进样口温度250℃，炉温180℃；采用程序升温，初始温度设定180℃并保持3min，再以2.5℃·min-1升至240℃，保持2min；载气为氦气，流速为1ml·min-1；质谱条件为采用分流模式，分流比为20:1；进样体积1μl；质谱离子源为ei源，温度280℃，能量70ev，全扫描模式，范围m/z 35～550amu。

17、本发明的优点：本发明利用脂质组学和植物化学分类学方法，有效解决了中药海藻(羊栖菜)与其同属其他海藻的区分难题，使中药海藻的真实性鉴别不再依赖于性状、显微鉴别的人为经验，为中药海藻(羊栖菜)真伪鉴别方法的制定提供了参考。本发明以脂肪酸比值作为质量标志物，从生合成特征方面能够更好地反映物种间的代谢调控差异，弥补了单一脂肪酸在种属水平鉴别研究的弊端，使中药海藻的鉴别更加简便、快速、准确。

技术特征：

1.一种利用脂肪酸标志物鉴别中药海藻的方法，其特征在于，通过测定c20:1 n-9/c16:1 n-7的比值来鉴别中药海藻；当c20:1 n-9/c16:1 n-7的比值范围在0.44~1.40之间时，即可判断为是中药海藻。

2.根据权利要求1所述的鉴别中药海藻的方法，其特征在于，所述中药海藻指的是羊栖菜。

3.根据权利要求1所述的鉴别中药海藻的方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的鉴别中药海藻的方法，其特征在于，步骤1）中的提取方式为索式回流提取。

5.根据权利要求3所述的鉴别中药海藻的方法，其特征在于，步骤2）中，所述皂化的溶液为1m氢氧化钾-甲醇溶液，反应温度为70 ℃，反应时间为10分钟。

6.根据权利要求3所述的鉴别中药海藻的方法，其特征在于，步骤2）中，所述甲酯化的试剂为1m盐酸-甲醇溶液，反应时间为10分钟。

7.根据权利要求3所述的鉴别中药海藻的方法，其特征在于，步骤3）中，气相色谱分析条件为使用omegawax 250毛细管色谱柱，进样口温度250 ℃，炉温180 ℃；采用程序升温，初始温度设定180 ℃并保持3 min，再以2.5 ℃·min-1升至240 ℃，保持2 min；载气为氦气，流速为1 ml·min-1；质谱条件为采用分流模式，分流比为20:1；进样体积1 μl；质谱离子源为ei源，温度280 ℃，能量70 ev，全扫描模式，范围m/z 35~550 amu。

技术总结
本发明公开了一种利用脂肪酸标志物鉴别中药海藻的方法，其特征在于，通过测定C20:1 n‑9/C16:1 n‑7的比值来鉴别中药海藻的真伪；当C20:1 n‑9/C16:1 n‑7的比值范围为0.44~1.40时，即可判断为中药海藻。本发明利用脂质组学和植物化学分类学方法有效解决了中药海藻与其同属易混伪品海藻的区分鉴别难题，使中药海藻的真实性鉴别不再依赖于性状、显微鉴别的人为经验，为中药海藻真伪鉴别方法的制定提供了参考。本发明以脂肪酸比值作为质量标志物，从生合成特征方面能够更好地反映物种间的代谢调控差异，弥补了单一脂肪酸在种属水平鉴别研究的弊端，使中药海藻的鉴别更加简便、快速、准确。

技术研发人员：刘红兵,耿玺承,马善鹏
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15