一种检测黄曲霉毒素B1(AFB1)的可折叠适配体传感器及其制备方法

本发明涉及生物传感器，具体涉及一种检测afb1的可折叠适配体传感器及其制备方法。

背景技术：

1、黄曲霉毒素b1（afb1）在黄曲霉毒素中表现出最强的致突变和致癌活性。因此，afb1被国际癌症研究机构确认为人类1类致癌物。在湿热条件下，afb1极易污染花生、玉米、大豆、小麦、坚果等农产品，极少量可对人畜造成严重危害。人们误食含有afb1的食物，也会对身体造成很大的伤害，如运动障碍、排泄停止、肝炎、黄疸等。在严重的情况下，它会导致肝癌、骨癌、癌症、乳腺癌，甚至死亡。鉴于afb1的巨大危害，世界各国都制定了食品、饲料和草药中黄曲霉毒素含量的限量标准，以确保公众健康和安全。这些极其严格的限量要求使得afb1的检测成为研究热点。所以开发一种便捷、高效、快速和实用的检测afb1方法，对维护食品安全、提高食品质量具有重要的理论和实际意义。

2、目前，国内外报道的afb1的测定方法主要有薄层色谱法（tlc）、高效液相色谱法（hplc）等。尽管这些方法灵敏度高，重现性好，但由于样品处理复杂，检测仪器昂贵，检测成本高，操作专业，不适合快速有效地检测afb1。随着社会技术的发展，已经发现了一些有前途的检测afb1的方法，如酶联免疫吸附试验（elisa）、表面等离子体共振（spr）、表面增强拉曼散射（sers）、荧光、比色法测定和电化学方法，其中电化学方法操作简单，灵敏度高，稳定性强，对于小分子物质的检测具有积极的响应；选用适配体作为识别分子，在保证灵敏度的前提下进一步提高了检测的专一性；并且电化学适配体传感器具有待测的样品不用经过预先处理、分析速度快、操作系统检单、准确度高、专一性强、成本低等优点。

3、本发明的目的在于提供一种能克服上述问题以及易制备、操作简单、灵敏度高、抗干扰性强、重现性、选择性及稳定性好的适配体传感器，构建的电化学生物传感器在afb1存在的情况下，与适配体结合使适配体发生折叠，导致修饰有mb的一端更靠近电极，使得电信号增大，通过对比添加afb1前后电信号的变化达到检测的目的。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述问题，本发明提供一种检测afb1的可折叠适配体传感器及其制备方法，基于适配体发生折叠前后在不同电位下产生可区分的dpv峰来构建适配体传感器，以提供一种易制备、操作简单、灵敏度高、抗干扰性强、重现性、选择性及稳定性好的电化学适配体传感器。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、一种检测afb1的适配体传感器，包含afb1适配体和玻碳电极，所述afb1适配体采用亚甲基蓝、巯基进行标记形成适配体功能化探针，所述玻碳电极的表面引入二硫化钼-多壁碳纳米管，标记后的可折叠适配体功能化探针通过金硫键固定于电极表面。

4、检测afb1的适配体传感器的制备方法，包括如下步骤：

5、(1) 巯基修饰适配体的还原：将15µm的巯基修饰的afb1适配体与1m的tcep混合，室温下还原30min，将带有二硫键的巯基还原；

6、(2) 玻碳电极表面处理：采用铝粉抛光玻碳电极后用超纯水清洗，然后分别在超纯水和无水乙醇中进行超声处理，再用氮气干燥，将处理过的电极放置在ph 7的kcl、[fe(cn)6]3-/4-混合溶液中，使用循环伏安法测试电极的预处理效果，扫描范围：-0.2-0.7v；扫描速度：100mv/s，预处理gce的cv曲线的峰值电位差低于100mv，进行下一步处理，将7μl的mos2@mwcnts滴加在电极表面并在27℃下放置2h；

7、(3) 通过金硫键将适配体组装在电极表面：将6µl的aunps滴加到mos2@mwcnts/gce表面，并在27℃下放置2h，然后滴加6µl适配体，并于27～30℃下孵育2～4h，然后在电极表面滴加6μl的bsa以封闭非特异性结合位点，即可获得适配体传感器。

8、更优地，所述巯基修饰适配体的还原中，适配体与tcep的体积比为：40:1。

9、更优地，所述纳米金分散液的制备过程为：将1ml浓度为1％的氯金酸和99ml的超纯水混合后搅拌，放在加热炉上加热至沸腾，保持搅拌状态下加入2.5ml浓度为1％的柠檬酸钠，继续加热10min-15min，直至溶液由灰色变为稳定的酒红色，自然搅拌冷却至室温后离心洗涤，最后恢复至原体积，即可得到纳米金分散液。

10、更优地，所述kcl、[fe(cn)6]3-/4-混合溶液中，kcl的浓度为0.1m，[fe(cn)6]3-/4-的浓度为5mm。

11、更优地，所述mos2@mwcnts的制备过程为：首先将20mg mos2粉末加入10ml乙醇中，并超声分散至均匀。然后，在室温下搅拌2小时，将20ml 1%pei溶液缓慢滴入所得溶液中。接下来，将分散在2ml超纯水中的10mg mwcnts 加入上述混合物中，并在室温下搅拌12小时。最后，以10000rpm离心3次并用超纯水洗涤合成的复合物，每次持续3分钟。最终产物浓度为2 mg ml-1。

12、综上所述，相比于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：

13、1、本发明运用亚甲基蓝(mb)和巯基(hs-sh)标记afb1适配体，利用电活性物质mb在适配体折叠前后在不同电位下产生的不同的dpv峰，利用巯基通过金硫键与纳米金相连将适配体固定，而构建用于检测afb1适配体传感器；在电极表面引入二硫化钼-多壁碳纳米管(mos2@mwcnts)纳米材料，增强了工作电极的生物相容性，比表面积和导电性能，从而增加适配体功能化探针在工作电极表面的固定量，为适配体与靶标物的结合提供生物相容性良好的界面，同时良好的导电性能进一步增强了适配体与靶标物结合时产生的电流变化，从而使得本申请提出的适配体传感器对afb1具有较良好的灵敏性、稳定性、重现性和抗干扰性，afb1的最低检出限也达到了0.0003ng；

14、2、本发明可应用于花生实际样品中afb1的检测，加标回收率良好；

15、3、本发明所属传感器构建方法通过更换不同的识别元件(其他种类适配体)，可用于其他不同种类真菌毒素的检测，从而更大范围内推广此类检测技术及应用，为快速、灵敏地检测多种真菌毒素提供技术支撑。

技术特征：

1.一种检测黄曲霉毒素b1(afb1)的可折叠适配体传感器，其特征在于：包含afb1适配体以及玻碳电极，所述afb1适配体采用亚甲基蓝、巯基进行标记形成适配体功能化探针，所述玻碳电极的表面引入二硫化钼-多壁碳纳米管与纳米金，标记后的可折叠适配体功能化探针通过金硫键固定于纳米金上。

2.一种如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素b1(afb1)的可折叠适配体传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.如权利要求2所述的检测afb1的适配体传感器的制备方法，其特征在于：所述巯基修饰适配体的还原中，适配体与tcep的体积比为：40:1。

4.如权利要求2所述的检测afb1的适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述纳米金分散液的制备过程为：将1ml浓度为1％的氯金酸和99ml的超纯水混合后搅拌，放在加热炉上加热至沸腾，保持搅拌状态下加入2.5ml浓度为1％的柠檬酸钠，继续加热10min-15min，直至溶液由灰色变为稳定的酒红色，自然搅拌冷却至室温后离心洗涤，最后恢复至原体积，即可得到纳米金分散液。

5.如权利要求2所述的检测afb1的适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述kcl、[fe(cn)6]3-/4-混合溶液中，kcl的浓度为0.1m，[fe(cn)6]3-/4-的浓度为5mm。

6.如权利要求2所述的检测afb1的适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述mos2@mwcnts的制备过程为：首先将20mg mos2粉末加入10ml乙醇中，并超声分散至均匀。然后，在室温下搅拌2小时，将20ml 1%pei溶液缓慢滴入所得溶液中。接下来，将分散在2ml超纯水中的10mg mwcnts 加入上述混合物中，并在室温下搅拌12小时。最后，以10000rpm离心3次并用超纯水洗涤合成的复合物，每次持续3分钟。最终产物浓度为2 mg ml-1。

技术总结
本发明公开了一种检测黄曲霉毒素B1(AFB1)的可折叠适配体传感器及其制备方法，涉及生物传感器技术领域；引入二硫化钼‑多壁碳纳米管(MoS2@MWCNTs)纳米材料与纳米金(AuNPs)提高工作电极的生物相容性，比表面积和导电性能，运用亚甲基蓝（MB）和巯基(HS‑SH)分别标记AFB1适配体，构建的可折叠适配体功能化探针通过金硫键固定到纳米金(AuNPs)上，该探针折叠前后可在差分脉冲伏安法(DPV)不同电位下产生可区分的电流峰以实现对AFB1的检测；构建的传感器具有较好的重现性、抗干扰性和稳定性，在实际样品检测中获得了满意的回收率。

技术研发人员：赵文苹,孟晓娅,桑茂盛,李忠钰,周全龙,孙霞,郭业民
受保护的技术使用者：山东理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16