一种新型冠状病毒样本预处理方法与流程

本申请属于生物样本检测领域，尤其涉及一种新型冠状病毒样本预处理方法。

背景技术：

1、在体外诊断领域，特别是在床旁检测(poct)领域中，能够简单、快速、低成本地获取准确的检验结果，是医学检验领域及医疗器械厂商的追求，在此过程中涌现了许多优秀的产品，各厂商也对其产品进行更新迭代。然而，厂商在提高优化产品性能时，常常仅对样本检测试剂进行优化，忽略了检测前的样本前处理步骤。

2、当前，基于金标准的实验室的诊断方法有很多，包括elisa测试、核酸扩增测试或细胞培养方法等，但都不适用于poc筛查。原因在于，以上诊断方法存在对操作人员要求高、仪器设备成本高以及耗时长等问题。

3、相反，基于侧向层析试剂快速诊断技术，具有进行大规模筛，检测试剂无需冷藏储存、操作简便、检测耗时短等优势，并且不需要额外的处理，也不需要检测设备的支持。

4、新冠病毒以胶体金/乳胶微球为示踪物的lfa诊断试剂灵敏度仍低于金标准实验室分析。尤其是当待测样本浓度较低的情况下，检测结果易出现假阴性，导致患者错过最佳治疗时间。

5、对于免疫层析方法检测病原体抗原检测试剂，常常使用鼻咽拭子、口咽拭子等作为采样器，取样后通常使用0.4～1ml的提取洗脱液进行拭子中标志物的洗脱，最后从洗脱液中吸取约3～4滴(体积约70-100微升)进行上样检测。

6、由于这种常规的样本前处理操作步骤常常受到采样不规范导致拭子头含标志物的浓度过少，甚至未采集到足够浓度的标记物，导致临床检测低丰度的抗原未能检出，普遍存在灵敏度低，假阴性高的现实问题。

7、厂商希望通过对下游的检测试剂进行优化进而提升系统整体检测性能往往事倍功半。具体地，针对鼻咽拭子类型的免疫层析技术路线，由于各种类型拭子具有一定程度的吸水性，采用小体积进行洗脱时，常常造成洗脱不完全或因为采样头的吸水性导致标志物的损失。而进行大体积洗脱时，虽然避免了不完全洗脱和吸水性的损失，但又因增大洗脱体积而造成的稀释，降低了标志物的浓度，因而造成了样本前处理的两难境地。除此之外，样本洗脱前处理完成后，还需从洗脱液中吸取更小体积的液体进行样本上样检测最终获得测试结果。

8、针对如前所述的洗脱困境及其衍生的检测上样体积问题，免疫层析、酶联免疫、分子诊断、技术路径的检测试剂常常因此应用受限，为改进试剂性能、提高检测能力，试剂生产厂家常常通过改进下游的试纸条或试剂工艺、选用更高成本的优质原料进行分析检测能力的提升，或进行更高效的标记载体，如大颗粒的胶体金60nm、100nm，甚至150nm大颗粒提高检测灵敏度、胶体碳、彩色乳胶微球等信号放大，引入链霉亲和素-生物素提高检测灵敏度。但相对而言，由此将产品性能提升一倍或几倍几乎不可能。

9、同理，针对其他不同的样本类型如血液、尿液、灌洗液样本类型也常常因为上样体积较小，样本检测目标物含量、纯度不高而存在检测能力受限、检测场景受限的问题。

10、有文献中提到，通过大颗粒金连接链霉亲和素与生物素化ssdna标记小颗粒金偶联抗体对抗原进行检测，虽然，该方法实现了更高的检测灵敏度，然而在实际使用中，该试纸条容易出现假阳性结果。分析认为，文献报道的这种信号放大系统是一个极不稳定的反应体系。理论上，只要样本中有一个分子就能被这种方法检出。但事实上，免疫学反应中不可能是绝对特异的，背景信号或多或少存在。此时，这种背景信号同样会被放大，进而导致假阳性结果。

11、申请内容

12、为了解决上述至少一种技术问题，开发一种成本低、快速、操作简便、灵敏度高的新型冠状病毒检测方法，本申请提供一种新型冠状病毒样本预处理方法。

13、第一方面，本申请提供一种新型冠状病毒样本预处理方法，所述预处理方法包括如下步骤：

14、s1、将聚乙二醇与pbs缓冲液混合，制备萃取剂a；

15、s2、将pbs缓冲液、磷酸盐和/或硫酸盐混合，制备萃取剂b；

16、s3、将萃取剂a和萃取剂b按体积1～9：1混匀，得到预处理液；

17、s4、提取待测样本，用灭菌拭子蘸取待测样本，加入到提取液内进行混匀，获得待测样本混合液；

18、s5、往预处理液中加入待测样本混合液，进行混匀处理后，进行离心处理，获得萃取剂a和萃取剂b完成分层的浓缩样本；

19、步骤s1所述萃取剂a中，乙二醇与pbs缓冲液的质量比为2～3：2；

20、步骤s2所述萃取剂b中，所述盐在萃取剂b中的质量百分比为1％～40％。

21、可选的，步骤s1所述萃取剂a中，乙二醇与pbs缓冲液的质量比为5～6：4。

22、优选的，步骤s1所述萃取剂a中，乙二醇与pbs缓冲液的质量比为3：2。

23、可选的，步骤s2所述萃取剂b中，所述盐在萃取剂b中的质量百分比为10％～40％。

24、优选的，步骤s2所述萃取剂b中，所述盐在萃取剂b中的质量百分比为20％～40％。

25、优选的，步骤s2所述萃取剂b中，所述盐在萃取剂b中的质量百分比为30％～40％。

26、可选的，步骤s3中萃取剂a和萃取剂b按体积5～9：1混匀，得到预处理液。

27、优选的，步骤s3中萃取剂a和萃取剂b按体积9：1混匀，得到预处理液。

28、可选的，步骤s5所述离心处理中离心处理频率为5000～6000rpm，离心处理时间为2～3min。

29、可选的，步骤s1所述pbs缓冲液浓度为10mol/ml；步骤s2所述pbs缓冲液浓度为10mol/ml。

30、综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：

31、本申请所述一种新型冠状病毒样本预处理方法具有成本低、检测精确度高、灵敏度高、操作简便等优势，可适用于床旁检测(poct)领域中。

技术实现思路

技术特征：

1.一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，所述预处理方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，步骤s1所述萃取剂a中，乙二醇与pbs缓冲液的质量比为5~6：4。

3.根据权利要求2所述的一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，步骤s1所述萃取剂a中，乙二醇与pbs缓冲液的质量比为3：2。

4.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，步骤s2所述萃取剂b中，所述盐在萃取剂b中的质量百分比为10%~40%。

5.根据权利要求4所述的一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，步骤s2所述萃取剂b中，所述盐在萃取剂b中的质量百分比为20%~40%。

6.根据权利要求5所述的一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，步骤s2所述萃取剂b中，所述盐在萃取剂b中的质量百分比为30%~40%。

7.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，步骤s3中萃取剂a和萃取剂b按体积5~9：1混匀，得到预处理液。

8.根据权利要求7所述的一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，步骤s3中萃取剂a和萃取剂b按体积9：1混匀，得到预处理液。

9.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，步骤s5所述离心处理中离心处理频率为5000~6000rpm，离心处理时间为2~3min。

10.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，步骤s1所述pbs缓冲液浓度为10mol/ml；步骤s2所述pbs缓冲液浓度为10mol/ml。

技术总结
本申请公开了一种新型冠状病毒样本预处理方法，本申请所述一种新型冠状病毒样本预处理方法的优点在于，所述预处理方法能够对新型冠状病毒样本进行快速地富集、浓缩及纯化，从而提高检测精确度，因此，本申请所述一种新型冠状病毒样本预处理方法具有检测灵敏度高、精确度高、成本低、操作简便等优势。

技术研发人员：王琦,肖宇强,陈粤秀,曹尹亮,刘时宇,李君秀
受保护的技术使用者：相达生物科技（深圳）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15