一种基于差示扫描荧光法的乳清蛋白快速鉴别方法及应用

本发明属于食品检测领域，涉及一种乳清蛋白鉴别方法，特别涉及一种基于差示扫描荧光法的乳清蛋白快速鉴别方法及应用。

背景技术：

1、乳清蛋白的种类和含量是乳及乳制品营养及商业价值的重要评价指标之一，因此其检测方法对于乳源真伪鉴别、乳制品加工工艺优化以及乳制品营养质量评估至关重要。乳清蛋白包含α-lac、β-lg、igg、lf等多种活性蛋白，具有很高的功能特性，但在商业化过程中，热加工处理是保证乳商品流通过程中质量稳定和符合卫生标准的必要条件，可以有效控制微生物指标，稳定货架期，但同时造成蛋白结构及活性功能改变，而这些变化的程度取决于热处理的温度和时间。不同热加工的乳制品具有不同的营养价值及市场价格，因此，对乳蛋白含量进行检测可以用于区分不同热加工工艺处理的乳制品，保护消费者的合法权益，可以对乳品生产工艺进行质量控制。热加工程度不同，乳清蛋白变性率也会不同，乳清蛋白变性率对乳制品的感官、质构、营养等存在极为重要的影响，也是酸奶、奶酪加工成功的重要影响因素，也是其品质优劣的重要评价指标。因此，乳清蛋白变性率测定方法是极为重要和必要的，对提高我国乳品质量具有非常重要的意义。此外，山羊乳、骆驼乳、牦牛乳等特色乳产量低，售价高，受经济利益驱使，以牛乳掺假的现象较为明显，乳清蛋白检测可以从蛋白角度开发不同乳源鉴别及常见乳源真伪检测方法，对于特色乳产业开发以及保障消费者安全与权益都有着重要的作用。已有的乳清蛋白鉴别检测方法，如电泳、色谱以及色谱-质谱等受成本、操作和仪器局限，仅能在实验室中进行，尚缺乏可用于生产实践的快速简便乳清蛋白检测技术。

2、差示扫描荧光技术(differential scanning fluorimetry，dsf)是一种利用程序控制温度缓慢上升过程中检测样品或者染料荧光信号的变化来检测样品中蛋白热变性过程的技术。相比热稳定分析的黄金标准差示扫描量热技术(differential scanningfluorimetry，dsc)，dsf具有以下优势[104]：(a)更大的适用浓度范围：dsc要求高浓度的蛋白才可以得到明显的变性峰，一般为0.2到2mg/ml，dsf则允许在0.005到200mg/ml范围内分析样品；(b)样本消耗量更少：dsc需要的样品体积通常为400μl，而dsf仅需10μl；(c)更高通量：dsc一次只能分析一个样本，通量较低，而dsf一次可以扫描检测的样品数量高达96个。

技术实现思路

1、本发明针对现有检测乳清蛋白鉴别的方法，如电泳、色谱以及色谱-质谱等受成本、操作、仪器等局限，只能在实验室中进行，提供一种可用于生产实践的快速、简便、低成本的乳清蛋白鉴别检测方法及试剂盒。

2、为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

3、一种基于差示扫描荧光法的乳清蛋白快速鉴别方法，包括如下步骤：

4、(1)样品制备：将目标蛋白：β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白、牛免疫球蛋白、牛乳铁蛋白用1×pbs溶解至10mg/ml作为标准蛋白储备液，按需稀释至不同浓度备用，利用醋酸缓冲液提取乳制品样本中的乳清蛋白；

5、(2)熔解分析：通过熔解对步骤(1)制备的样品进行分析，分别得到350nm的dsf曲线，350nm/330nm比值通道的dsf曲线、以及两种熔解曲线的熔解峰曲线；

6、(3)数据处理：对熔解曲线信息进行pca分析，提取每种乳清蛋白熔解曲线或熔解峰曲线的特征值，形成特征值熔解信息库进行lda分析，根据蛋白的熔解信息差异对其进行区分。

7、优选的，步骤(1)中所述乳清蛋白浓度为＞0.2mg/ml，ph范围为4.0～7.4。

8、优选的，步骤(1)中所述乳品选自生乳、奶粉或液态乳制品。

9、优选的，步骤(1)中所述乳制品样本包含牛乳、羊乳、驼乳、牦牛乳、水牛乳、驴乳、马乳。

10、优选的，步骤(1)中所述乳制品样本需用ph4.0～5.0的醋酸缓冲液处理，提取乳清蛋白。

11、优选的，步骤(2)中所述dsf检测参数为：扫描温度范围：35～95℃，升温速率为6℃/min～30℃/min。

12、基于前述任一种基于差示扫描荧光法的乳清蛋白快速鉴别方法的应用，应用于不同来源乳清蛋白的快速鉴别，具体方法为：选取可以获得三种不同来源igg、不同来源sa、不同来源lf稳定熔解曲线的浓度＞0.1mg/ml及ph4.0～7.4，进行复孔dsf熔解实验，每种蛋白重复五次，获得不同来源igg、sa及lf的特征熔解曲线和熔解峰曲线，输入整个熔解曲线信息至metaboanalyst5.0进行pca主成分分析，对igg、sa及lf蛋白源性进行鉴别。

13、基于前述任一种基于差示扫描荧光法的乳清蛋白快速鉴别方法的应用：应用于乳清蛋白变性率的快速检测，具体方法为：首先以未热处理的乳清蛋白熔解峰面积作为对照，根据熔解峰面积计算不同热处理条件下剩余活性乳清蛋白含量；然后以生乳中提取的乳清蛋白熔解峰面积作为对照，根据熔解峰面积计算不同热加工工艺样品中剩余活性乳清蛋白含量。

14、基于前述任一种基于差示扫描荧光法的乳清蛋白快速鉴别方法的应用：应用于不同热加工工艺乳的快速鉴别检测，具体方法为：用醋酸缓冲液提取不同热加工工艺乳中的乳清蛋白，取10μl用醋酸缓冲液提取的不同热加工工艺乳中的乳清蛋白样品进行熔解，每个样品重复5次，进行熔解分析，获取不同热加工工艺乳熔解曲线后，输入整个熔解曲线信息至metaboanalyst5.0进行pca主成分分析，进行鉴别。

15、基于前述任一种基于差示扫描荧光法的乳清蛋白快速鉴别方法的应用：应用于不同来源乳的快速掺假鉴别检测，具体方法为：称取液态生鲜牛乳、生鲜羊乳、生鲜骆驼乳各0.04g分别加入特定ph的醋酸缓冲溶液定容至1ml后振荡混匀，12000rpm、4℃、10min离心，除去上层脂肪和下层沉淀，取中间层转移至干净的离心管，储存在-20℃，取10μl上述处理得到的样品进行熔解检测，获得牛、羊、骆驼乳乳清蛋白的特征熔解曲线；取制备的混合液10μl进行熔解检测，用以确定其掺假检出限；取10μl处理的样品进行熔解检测，实现对羊乳中掺入牛乳以及驼乳中掺入牛乳的定量分析。

16、本发明的有益效果体现在：

17、本发明通过dsf对可以获得蛋白质的熔解曲线，分别获得不同种类乳清蛋白、不同来源乳清蛋白的稳定的熔解曲线以及熔解峰曲线，进而利用熔解曲线的差异性，结合差异曲线特征提取及统计分析方法，建立五种牛乳清蛋白的鉴别检测方法。本发明只需简单的醋酸提取前处理，适用于乳及乳制品中乳清蛋白变性率的测定，不同热加工工艺的区分以及不同乳源的快速鉴别检测，具有较强的实际应用潜力。能够对乳品企业加工工艺的精准控制提供指导，为乳源真伪鉴定提供新方案，评估乳及乳制品营养价值，促进乳制品行业健康发展。该方法操作简便快捷，通量高，无需专业的技术人员进行操作，检测成本低。

技术特征：

1.一种基于差示扫描荧光法的乳清蛋白快速鉴别方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种基于差示扫描荧光法的乳清蛋白快速鉴别方法，其特征在于：步骤(1)中所述乳清蛋白浓度为＞0.2mg/ml，ph范围为4.0～7.4。

3.根据权利要求1所述的一种基于差示扫描荧光法的乳清蛋白快速鉴别方法，其特征在于：步骤(1)中所述乳品选自生乳、奶粉或液态乳制品。

4.根据权利要求1所述的一种基于差示扫描荧光法的乳清蛋白快速鉴别方法，其特征在于：步骤(1)中所述乳制品样本包含牛乳、羊乳、驼乳、牦牛乳、水牛乳、驴乳、马乳。

5.根据权利要求1所述的一种基于差示扫描荧光法的乳清蛋白快速鉴别方法，其特征在于：步骤(1)中所述乳制品样本需用ph4.0～5.0的醋酸缓冲液处理，提取乳清蛋白。

6.根据权利要求1所述的一种基于差示扫描荧光法的乳清蛋白快速鉴别方法，其特征在于：步骤(2)中所述dsf检测参数为：扫描温度范围：35～95℃，升温速率为6℃/min～30℃/min。

7.根据权利要求1-5任一项所述的一种基于差示扫描荧光法的乳清蛋白快速鉴别方法的应用，其特征在于：应用于不同来源乳清蛋白的快速鉴别，具体方法为：选取可以获得三种不同来源igg、不同来源sa、不同来源lf稳定熔解曲线的浓度＞0.1mg/ml及ph4.0～7.4，进行复孔dsf熔解实验，每种蛋白重复五次，获得不同来源igg、sa及lf的特征熔解曲线和熔解峰曲线，输入整个熔解曲线信息至metaboanalyst5.0进行pca主成分分析，对igg、sa及lf蛋白源性进行鉴别。

8.根据权利要求1-5任一项所述的一种基于差示扫描荧光法的乳清蛋白快速鉴别方法的应用，其特征在于：应用于乳清蛋白变性率的快速检测，具体方法为：首先以未热处理的乳清蛋白熔解峰面积作为对照，根据熔解峰面积计算不同热处理条件下剩余活性乳清蛋白含量；然后以生乳中提取的乳清蛋白熔解峰面积作为对照，根据熔解峰面积计算不同热加工工艺样品中剩余活性乳清蛋白含量。

9.根据权利要求1-5任一项所述的一种基于差示扫描荧光法的乳清蛋白快速鉴别方法的应用，其特征在于：应用于不同热加工工艺乳的快速鉴别检测，具体方法为：用醋酸缓冲液提取不同热加工工艺乳中的乳清蛋白，取10μl用醋酸缓冲液提取的不同热加工工艺乳中的乳清蛋白样品进行熔解，每个样品重复5次，进行熔解分析，获取不同热加工工艺乳熔解曲线后，输入整个熔解曲线信息至metaboanalyst5.0进行pca主成分分析，进行鉴别。

10.根据权利要求1-5任一项所述的一种基于差示扫描荧光法的乳清蛋白快速鉴别方法的应用，其特征在于：应用于不同来源乳的快速掺假鉴别检测，具体方法为：称取液态生鲜牛乳、生鲜羊乳、生鲜骆驼乳各0.04g分别加入特定ph的醋酸缓冲溶液定容至1ml后振荡混匀，12000rpm、4℃、10min离心，除去上层脂肪和下层沉淀，取中间层转移至干净的离心管，储存在-20℃，取10μl上述处理得到的样品进行熔解检测，获得牛、羊、骆驼乳乳清蛋白的特征熔解曲线；取制备的混合液10μl进行熔解检测，用以确定其掺假检出限；取10μl处理的样品进行熔解检测，实现对羊乳中掺入牛乳以及驼乳中掺入牛乳的定量分析。

技术总结
本发明属于食品检测领域，公开了一种基于差示扫描荧光法的乳清蛋白快速鉴别方法及应用。该方法通过差示扫描荧光检测技术(DSF)，以乳清蛋白本身的内源性荧光信号获取热稳定差异曲线，利用各乳清蛋白热稳定差异曲线特征提取及统计分析方法，建立五种牛乳清蛋白的鉴别方法。本发明只需简单的醋酸提取前处理，适用于乳及乳制品中乳清蛋白变性率的测定，不同热加工工艺的区分以及不同乳源的快速鉴别检测。该方法克服了已有的乳清蛋白鉴别检测方法，如电泳、色谱以及色谱‑质谱等受成本、操作和仪器局限的缺点，可用于生产实践的快速、简便、高通量、低成本的乳制品质量控制。

技术研发人员：徐秦峰,赵婉怡,路梦凡,魏雨杰,宋娟娜
受保护的技术使用者：陕西科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16