离体生物组织样本的血管染色方法与流程

本发明涉及生物，具体地说，涉及离体生物组织样本染色方法。

背景技术：

1、目前已有的静脉注射或者心脏灌流等血管标记方法只能针对非人类活体组织，而对于人类病理组织和离体非人类生物组织，通常是将离体组织进行切片，然后切片进行逐个染色，此类方法操作复杂，耗时较长，难以快速获取数据，并且切片层与层之间难以配准，不可避免地造成数据缺失，无法得到厚组织完整血管染色结果。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供离体生物组织样本的血管染色方法。

2、为了实现本发明目的，本发明提供一种离体生物组织样本染色方法，包括以下步骤：

3、(1)在超声波水浴设备中，采用水溶性有机试剂对整块离体生物组织样本(样本大小≤8㎝3)进行梯度脱水；

4、(2)在水浴设备中，采用脂溶性有机试剂对脱水后的样本进行去脂；

5、(3)在超声波水浴设备中，采用水溶性有机试剂对去脂后的样本进行梯度富水；

6、(4)在超声波水浴设备中，采用染料试剂对富水后的样本进行染色，然后用1×pbs溶液漂洗，完成染色。

7、进一步地，步骤(1)和(3)所述水溶性有机试剂可选自甲醇、乙醇、乙二醇、丙酮、异丙醇、叔丁醇、四氢呋喃等中的一种或多种，优选乙醇。

8、进一步地，步骤(2)所述脂溶性有机试剂可选自丙三醇、二甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、乙醚等中的一种或多种，优选二氯甲烷。

9、进一步地，步骤(4)所述染料试剂可选自fitc、凝集素或cd31抗体等，优选质量百分比为0.00001％-0.5％的fitc。

10、若未特别指明，本发明中使用的试剂均为分析纯。

11、进一步地，步骤(1)梯度脱水的条件为：超声波的频率为20khz-100khz，超声功率10-1000w，温度为30℃-75℃。

12、脱水使用的乙醇梯度，乙醇是从低浓度到高浓度，最后到无水乙醇。

13、进一步地，步骤(2)去脂的条件为：水浴温度为30℃-45℃。

14、去脂使用的二氯甲烷为分析纯。

15、进一步地，步骤(3)梯度富水的条件为：超声波的频率为20khz-100khz，超声功率10-1000w，温度为30℃-75℃。

16、富水使用的乙醇梯度，乙醇是从高浓度到低浓度，最后到蒸馏水。

17、进一步地，步骤(4)染色的条件为：超声波的频率为20khz-100khz，超声功率10-1000w，温度为0℃-75℃。

18、fitc血管染色在温度30℃-75℃下进行，凝集素、cd31抗体染色在温度4℃下进行。以小鼠鼠脑为例，总共超声12-24h。

19、本发明中，染色后的样本经包埋处理后，于显微镜成像或tdi-fmost成像。

20、优选地，所述离体生物组织样本来自人类。

21、所述离体生物组织样本包括固定后的病理标本、冷冻后的组织等。

22、在本发明的一个具体实施方式中，离体生物组织样本染色方法包括以下步骤：

23、1)在超声波水浴设备中，采用乙醇对离体生物组织样本(样本大小≤8㎝3)进行梯度脱水；具体处理条件为：超声波的频率为20khz-100khz，超声功率10-1000w，温度为30℃-75℃。

24、2)在水浴设备(水浴温度30℃-45℃)中，采用二氯甲烷(分析纯)对脱水后的样本进行去脂。

25、3)在超声波水浴设备中，采用乙醇对去脂后的样本进行梯度富水；具体处理条件为：超声波的频率为20khz-100khz，超声功率10-1000w，温度为30℃-75℃。

26、4)在超声波水浴设备中，采用质量百分比为0.00001％-0.5％的fitc对富水后的样本进行染色；具体处理条件为：超声波的频率为20khz-100khz，超声功率10-1000w，温度为0℃-75℃。最后用1×pbs溶液漂洗，完成染色。

27、5)包埋后成像。

28、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

29、(一)本发明基于超声波水浴设备，利用特定波长的超声波和水浴技术，加快溶液中各种试剂分子渗透速度，同时利用化学试剂增加组织通透性；然后使用血管染料进行离体组织染色，能够完成各种离体组织血管标记。

30、(二)本方法对于各类离体组织均有稳定标准的制备方案，可保证染色组织的染色完整性。

31、(三)采用本发明提供的血管染色方法，首次完成人类血管染色，能够给病理诊断方向提供判断依据。

32、(四)采用本发明提供的血管染色方法，能够完成组织血管整体染色，对比传统切片染色，耗时短，自动匹配，可以得到组织血管三维结构。

技术特征：

1.离体生物组织样本的血管染色方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)和(3)所述水溶性有机试剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、丙酮、异丙醇、叔丁醇、四氢呋喃中的一种或多种，优选乙醇。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述脂溶性有机试剂选自丙三醇、二甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、乙醚中的一种或多种，优选二氯甲烷。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述染料试剂选自fitc、凝集素或cd31抗体，优选质量百分比为0.00001％-0.5％的fitc。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)梯度脱水的条件为：超声波的频率为20khz-100khz，超声功率10-1000w，温度为30℃-75℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)去脂的条件为：水浴温度为30℃-45℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)梯度富水的条件为：超声波的频率为20khz-100khz，超声功率10-1000w，温度为30℃-75℃。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)染色的条件为：超声波的频率为20khz-100khz，超声功率10-1000w，温度为0℃-75℃。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，染色后的样本经包埋处理后，于显微镜成像或tdi-fmost成像。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述离体生物组织样本来自人类。

技术总结
本发明提供一种离体生物组织样本的血管染色方法。本发明基于超声波水浴设备，利用特定波长的超声波和水浴技术，加快溶液中各种试剂分子渗透速度，同时利用化学试剂增加组织通透性；然后使用血管染料进行离体组织染色，能够完成各种离体组织血管标记。采用本发明提供的血管染色方法，能够完成组织血管整体染色，对比传统切片染色，耗时短，自动匹配，可以得到离体组织血管三维结构，对病理学研究有重大意义。

技术研发人员：郑廷,毛珂,陈谦
受保护的技术使用者：武汉沃亿生物有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16