一种2,4-DNT电化学生物传感器及其构建方法和应用

本发明属于分子生物学，具体涉及一种2,4-dnt电化学生物传感器及其构建方法和应用。

背景技术：

1、安全、准确无遗留的排除战后遗留雷场的方法对全世界都具有重大意义。传统的排雷手段为金属探测排雷，排除过程不确定性高，很容易带来人员伤亡。为了避免人员的伤亡，许多基于动物感官的方法也被应用于地雷的检测，如非洲大鼠、狗、猪、蜜蜂等，但收效不佳，容易造成一些假阴性而导致不必要的伤亡；声波和雷达探测主要基于探测者的主观判断还有地雷的材质等因素，并且大多数情况下需要身赴雷区，具有很大的危险性，并且无法针对目前出现的陶瓷、塑料等新型材质的地雷进行探测。因此，相对安全且易于操作的地雷生物传感器检测手段应运而生。利用荧光蛋白(如gfp)作为爆炸物分子的报告基因，将gfp编码基因连接至与爆炸物分子代谢酶的调控基因的下游，使得gfp基因可受爆炸物分子所诱导表达，从而检测地雷位置。但该方法存在的不足是反应时间过长，环境要求高，且具有本底干扰。

2、微生物表面展示技术是利用基因工程手段实现外源肽段(或蛋白质结构域)以融合蛋白形式在微生物表面进行展示的新型基因工程技术，被展示的多肽或蛋白质可以保持相对独立的空间结构和生物活性。

3、本发明首次利用电化学检测的方式，对利用细胞表面展示系统展示脱氢酶并稳定表达，其对爆炸物分子能够进行高效的检测，进而提高地雷检测的准确性和安全性。

技术实现思路

1、本发明提供了一种2,4-dnt电化学生物传感器及其构建方法和应用。本发明首次运用电化学检测技术，在大肠杆菌体内，利用对2,4-dnt报告的c55启动子元件启动锚定蛋白和脱氢酶融合蛋白的表达，进而实现对爆炸物分子高效的检测。

2、为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明提供了一种2,4-dnt电化学生物传感器，其中含有锚定蛋白的编码基因以及所述锚定蛋白携带的脱氢酶的编码基因。

4、进一步的，所述锚定蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示、或者如seq id no.2所示、或者如seq id no.3所示。

5、进一步的，所述脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示、或者如seqid no.5所示、或者如seq id no.6所示。

6、进一步的，所述2,4-dnt电化学生物传感器具有显著降低背景干扰、提高爆炸物分子检测灵敏度的能力。

7、本发明还提供了所述的2,4-dnt电化学生物传感器的构建方法，其包括以下步骤：

8、(1)以n-pbr-c55-luxpleio质粒为模版进行扩增，得到pbr-c55载体片段；

9、(2)以锚定蛋白的编码基因和脱氢酶的编码基因为模版进行扩增，得到锚定蛋白和脱氢酶的融合基因片段；

10、(3)将所述pbr-c55载体片段与融合基因片段进行连接、转化到感受态细胞，得到重组菌株，为2,4-dnt电化学生物传感器。

11、进一步的，所述步骤(1)中扩增的引物序列为：

12、pbr-c55-f：5'-catcgttcatatttgcccctcctgagctcgccact-3'；

13、pbr-c55-r：5'-ctggcgttgattaaaatcattatttaactctaaat-3'。

14、进一步的，所述锚定蛋白和脱氢酶的融合基因片段的核苷酸序列如seq idno.19、或者如seq id no.20、或者如seq id no.21、或者如seq id no.22、或者如seq idno.23所示。

15、本发明还提供了所述的2,4-dnt电化学生物传感器在组装电化学工作站中的应用。

16、进一步的，所述电化学工作站中包括2,4-dnt电化学生物传感器、铂片电极、饱和甘汞电极、玻碳电极、抛光粉、标准溶液、反应底物。

17、本发明还提供了所述的2,4-dnt电化学生物传感器或者所述的电化学工作站在爆炸物分子检测中的应用。

18、进一步的，所述2,4-dnt电化学生物传感器或者电化学工作站检测爆炸物分子的灵敏度≥0.05mg/l。

19、优选的，所述2,4-dnt电化学生物传感器或者电化学工作站检测爆炸物分子的灵敏度为0.05mg/l-20mg/l。

20、进一步的，所述爆炸物分子为2,4-dnt、1,3-二硝基苯、对苯二酚、1,2,4-苯三酚或者邻甲基对苯二酚。

21、本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

22、本发明首次运用电化学检测技术，在大肠杆菌体内，利用对2,4-dnt报告的c55启动子元件启动融合蛋白的表达构建了工程菌株，即为2,4-dnt电化学生物传感器。所述2,4-dnt电化学生物传感器具有显著提高爆炸物分子检测灵敏度的能力，且构建方法简单，响应快速，样品需量少，检测成本低；而且所述2,4-dnt电化学生物传感器对多种爆炸物分子的降解产物均有明显效果，且该检测方法可以避免本底干扰，这是至关重要的。本发明的方法颠覆了传统检测技术，开发出一种针对爆炸物分子快速高效安全检测的关键技术，不仅可用于军工业上地雷等炸药的检测，也可用于生态系统中的有毒物质的检测，且不受环境的影响。本发明利用所述2,4-dnt电化学生物传感器进行爆炸物检测的方法可与传统的爆炸物检测方法互为补充，从而显著提高爆炸物检测的准确性、安全性和效率。因此对军事、反恐和环保等方面都具有重要的意义。

技术特征：

1.一种2,4-dnt电化学生物传感器，其特征在于，所述2,4-dnt电化学生物传感器中含有锚定蛋白的编码基因以及所述锚定蛋白携带的脱氢酶的编码基因。

2.根据权利要求1所示的2,4-dnt电化学生物传感器，其特征在于，所述锚定蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示、或者如seq id no.2所示、或者如seq id no.3所示。

3.根据权利要求1所示的2,4-dnt电化学生物传感器，其特征在于，所述脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示、或者如seq id no.5所示、或者如seq id no.6所示。

4.权利要求1所述的2,4-dnt电化学生物传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中扩增的引物序列为：

6.权利要求1所述的2,4-dnt电化学生物传感器在组装电化学工作站中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述电化学工作站中包括2,4-dnt电化学生物传感器、铂片电极、饱和甘汞电极、玻碳电极、抛光粉、标准溶液、反应底物。

8.权利要求1所述的2,4-dnt电化学生物传感器或者权利要求6所述的电化学工作站在爆炸物分子检测中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述2,4-dnt电化学生物传感器或者电化学工作站检测爆炸物分子的灵敏度≥0.05mg/l。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述爆炸物分子为2,4-dnt、1,3-二硝基苯、对苯二酚、1,2,4-苯三酚或者邻甲基对苯二酚。

技术总结
本发明公开了一种2,4‑DNT电化学生物传感器及其构建方法和应用。所述2,4‑DNT电化学生物传感器中含有锚定蛋白的编码基因以及所述锚定蛋白携带的脱氢酶的编码基因。所述2,4‑DNT电化学生物传感器具有显著降低背景干扰、提高爆炸物分子检测灵敏度的能力。本发明的2,4‑DNT电化学生物传感器的构建方法步骤简单，响应快速，样品需量少，检测成本低。本发明利用所述2,4‑DNT电化学生物传感器进行爆炸物检测的方法可与传统的爆炸物检测方法互为补充，从而显著提高爆炸物检测的准确性、安全性和效率。

技术研发人员：梁波,杨建明,王璐,赵蕾,徐超,殷岳萌,张照
受保护的技术使用者：青岛农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15