一种炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素的检测方法与流程

本发明涉及一种炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素的检测方法，属于中药饮片质量检测领域。

背景技术：

1、僵蚕是一种中药材，具有补气益血、止血化瘀、消肿止痛等功效，常用于治疗贫血、月经不调、瘀血痛经、跌打损伤等症。僵蚕在采收、加工、贮藏过程中，容易受到黄曲霉的污染，产生黄曲霉毒素。黄曲霉毒素是一类具有强致癌性和致突变性的真菌毒素，主要有黄曲霉毒素b1、b2、g1和g2四种，其中黄曲霉毒素b1的毒性最强。黄曲霉毒素对人体健康和动物生产造成严重危害，已被世界卫生组织和欧盟等制定了严格的限量标准。

2、为了保证僵蚕饮片的质量安全，需要对其进行黄曲霉毒素的检测。目前已有多种方法用于检测中药中的黄曲霉毒素，如：

3、专利cn106053662a公开了一种用于测量中药中黄曲霉素b1含量的方法。该方法包括：将中药溶液的ph调节至2-5，加入磁性纳米颗粒，均匀混合，在外部磁场下使混合溶液分层，去除上清液，将下层沉淀物加入体积比2:1的二氯甲烷和丙酮混合液中；搅拌解吸附，在外加磁场作用下分层，收集上层清液进行hplc检测。但该方法操作复杂，不利于黄曲霉素的快速检测。

4、专利cn106770806a公开了一种同时测定中成药中黄曲霉素b1，b2含量的方法；其采用正硅酸乙酯-3-氨基丙基三乙氧基硅烷修饰四氧化三铁磁性纳米颗粒作为磁性固相萃取的吸附剂，首次将其使用于黄曲霉毒素b1，b2的富集中，具有操作简便、成本低、准确度高等特点。

5、专利cn105823844a公开了一种中药饮片中黄曲霉毒素的检测方法，其包括粉碎、酸浸、清洗、提取、高效液相色谱检测步骤。重点在于将中药粉末置于质量浓度为1.7％的乙酸中浸润2小时，然后用乙腈提取进行hplc检测。该方法检测黄曲霉素效率高，但是样品处理时间过长。

6、专利cn108693273a公开了一种中药中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的检测方法，去除大部分的水溶性杂质，降低这部分杂质对免疫亲和柱的干扰，促进提取液中杂质成分的溶解，降低其在免疫亲和柱上的吸附，从而提高免疫亲和柱的纯化效果，降低杂质干扰。

7、专利cn103896959a公开了糟醅中黄曲霉毒素b1的提取方法，其包括如下步骤：称取烘干的糟醅，过筛，加入甲醇水溶液、二氯甲烷或丙酮超声波震荡后过滤，取滤液备用，用二氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮萃取滤液，收集二氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮层并烘干即可。

8、以上各种方法各有优缺点，在实际应用中需要根据不同的需求和条件进行选择。然而目前还没有一种方法能够同时满足快速、简便、灵敏、准确、低成本等要求。因此开发一种适用于炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素的检测方法是迫切需要解决的问题。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于克服传统样品前处理方法繁琐耗时、消耗大量有机溶剂、分析成本高的缺点，提供一种炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素的检测方法。本发明的方法能够同时满足快速、简便、灵敏、准确、低成本等要求。

2、为实现上述目的，本发明提出以下技术方案：

3、一种炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素的检测方法，包括以下步骤：

4、(1)样品前处理：

5、1)提取：称取固体样品炒僵蚕饮片，干燥后粉碎并过300目筛，得炒僵蚕饮片粉末；在炒僵蚕饮片粉末中加入相当于样品质量4-6倍的甲醇-丙酮混合溶剂，剧烈振5min-30min，以100w-500w的超声功率超声提取10-30min，制得提取液；其中，甲醇-丙酮混合溶剂中甲醇与丙酮体积比为1:(1-5)；

6、2)净化：将步骤1)制得的提取液中加入相当于步骤1)中样品质量0.4％-0.8％的盐析剂硫酸镁和氯化钠，以1000r/min-2000r/min的转速混合搅拌1min-10min，然后以1000r/min-4000r/min的转速离心5min-15min，经0.25μm孔径的滤膜过滤，所得滤液即为炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素的待测液；

7、(2)样品测定：

8、1)将步骤(1)所得的炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素的待测液用高效液相色谱-荧光检测器(hplc-fld)进行检测分析；所述hplc-fld的检测条件为：液相色谱采用watersalliance2695高效液相色谱系统，分析柱为insert ods-3柱(250×4.6mm，5μm)；流动相采用体积比为4:5的乙腈与水的混合溶液，流速：0.8-1.2ml/min；柱温：20℃-40℃；所述荧光检测器：发射波长440nm，激发波长360nm；

9、2)称取黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2标准品，用甲醇配制成混合标准品溶液，取不同量的混合标准品溶液，在与步骤1)相同的高效液相色谱检测条件下进行检测；以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，回归系数的平方(r2)和线性范围；

10、3)根据步骤1)待测液的高效液相色谱图中的出峰时间确定黄曲霉毒素的具体类别，并将黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2相应吸收峰的峰面积数值代入步骤2)建立的线性回归方程中，计算得到待测液中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的含量，进而推算出待测炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的含量。

11、所述的炒僵蚕饮片中待测黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素g2。

12、优选的，上述步骤(1)中超声提取条件为400w，时间为15-20min。

13、优选的，上述步骤(1)中甲醇-丙酮混合溶剂中甲醇与丙酮体积比为1:(1-3)。

14、更优选的，上述步骤(1)中甲醇-丙酮混合溶剂中甲醇与丙酮体积比为1:2。

15、优选的，上述步骤(1)中盐析剂为硫酸镁和氯化钠按照质量比1:(1-4)混合成的混合物。

16、更优选的，上述步骤(1)中盐析剂为硫酸镁和氯化钠按照质量比1:2混合成的混合物。

17、本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

18、(1)本发明通过对粉碎后的炒僵蚕饮片经甲醇-丙酮混合溶剂超声提取，然后用硫酸镁和氯化钠盐析净化等步骤，实现炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素快速的富集净化，净化效果好，避免了传统样品前处理方法使用亲和柱净化、繁琐耗时、消耗大量有机溶剂、分析成本高的缺点。

19、(2)本发明所述的前处理方法结合高效液相色谱-荧光检测，实现了对黄曲霉毒素的快速分离和检测，建立了炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素快速、有效和灵敏的分析方法，检测灵敏度和准确性高。

技术特征：

1.一种炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素的检测方法，其特征在于，所述的炒僵蚕饮片中待测黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素g2。

3.根据权利要求1所述的炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中超声提取条件为400w，时间为15-20min。

4.根据权利要求1所述的炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中甲醇-丙酮混合溶剂中甲醇与丙酮体积比为1:(1-3)。

5.根据权利要求1所述的炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中甲醇-丙酮混合溶剂中甲醇与丙酮体积比为1:2。

6.根据权利要求1所述的炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中盐析剂为硫酸镁和氯化钠按照质量比1:(1-4)混合成的混合物。

7.根据权利要求1所述的炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中盐析剂为硫酸镁和氯化钠按照质量比1:2混合成的混合物。

技术总结
本发明公开了一种炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素的检测方法，主要是通过对粉碎后的炒僵蚕饮片经甲醇‑丙酮混合溶剂超声提取，然后用硫酸镁和氯化钠盐析净化等步骤，实现炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素快速的富集净化，避免了传统样品前处理方法使用亲和柱净化、繁琐耗时、消耗大量有机溶剂、分析成本高的缺点。并且前处理方法结合高效液相色谱‑荧光检测，实现了对黄曲霉毒素的快速分离和检测，建立了炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素快速、有效和灵敏的分析方法，检测灵敏度和准确性高。

技术研发人员：刘亮,周冰琴,李丹丹,张志强,胡亚伟
受保护的技术使用者：安徽天祥药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16