一种两段式检测16种嘌呤核酸物质的高效液相色谱方法

本发明具体涉及一种两段式检测16种嘌呤核酸物质的方法，属于化学检测。

背景技术：

1、嘌呤核酸物质是一类重要的有机分子，它在人体中扮演着多种生物学过程的关键角色，包括dna和rna合成、能量代谢以及信号传导等。在人体内嘌呤核酸分解代谢过程包括腺苷酸和鸟苷酸在核苷酸酶的作用下，水解产生腺苷和鸟苷。腺苷可在脱氨酶的作用下生成肌苷，并在核苷酶的作用下生成肌苷酸，通过黄嘌呤氧化酶作用下，生成黄嘌呤，最终生成尿酸；腺苷和鸟苷在核苷酶的作用下生成游离的嘌呤碱基，腺嘌呤转化为次黄嘌呤，与鸟嘌呤一同转变为黄嘌呤，再在黄嘌呤氧化酶的催化下代谢为尿酸。脱氧腺苷酸和脱氧鸟苷酸通过相同途径最终也代谢为尿酸，并随尿液排除体外。嘌呤核酸及其中间代谢产物具有多种生理功能，比如腺苷具有有效的血管舒张作用；腺嘌呤有助于调节心率、缓解疲劳、加强机体的免疫功能。但嘌呤核酸的终代谢产物尿酸如果分泌过多或排泄障碍均会导致高尿酸血症，可引起心血管疾病、痛风、肾脏疾病等。因此，基于嘌呤核苷酸及相关代谢化合物水平的检测在生理学和药理学研究方面有很大的意义。

2、常用的嘌呤核酸物质检测方法包括高效液相色谱法、电化学方法、光谱法等。但这些方法大多只检测尿酸生成的几种相关前体物质比如腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤等，且部分检测法如液相色谱-串联质谱，分析成本高、样品前处理复杂。

3、目前，尚未发现一种方法能够有效对血清中嘌呤核酸的代谢的全部中间产物如相关核苷酸、核苷和嘌呤碱基进行定量、定性检测。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种两段式检测16种嘌呤核酸物质的高效液相色谱方法，以弥补现有技术的不足。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一种两段式检测16种嘌呤核酸物质的高效液相色谱方法，该方法包括以下步骤：

4、(1)配制标准品溶液：分别制备鸟苷酸、鸟苷、鸟嘌呤、腺苷酸、腺苷、腺嘌呤、肌苷酸、肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、脱氧腺苷酸、脱氧腺苷、脱氧肌苷酸、脱氧肌苷、脱氧鸟苷酸、脱氧鸟苷的标准储备液；

5、(2)配制两种混合标准品溶液：将鸟苷酸、肌苷酸、黄嘌呤、脱氧肌苷酸、腺嘌呤、脱氧腺苷、肌苷、脱氧肌苷、脱氧鸟苷、脱氧腺苷酸、鸟苷、腺苷、脱氧腺苷共计12种嘌呤核酸物质标准储备液混合，配制成浓度为混合标准储备液一，然后进行稀释，配置一系列浓度梯度混合工作液一；将腺苷酸、次黄嘌呤、脱氧鸟苷酸、鸟嘌呤标准储备液混合，配制成混合标准储备液二，然后进行稀释，配置一系列浓度梯度混合工作液二；

6、(3)第一段在流动相呈酸性条件下对12种嘌呤核酸标准品进行高效液相色谱检测；

7、(4)第二段在流动相呈碱性条件下对其余4种嘌呤核酸标准品进行高效液相色谱检测；

8、(5)绘制标准曲线；

9、(6)对待测样品进行前处理，以进行高效液相色谱检测；

10、(7)在流动相呈酸性条件下对前处理后的样品进行高效液相色谱检测，然后将流动相调成碱性再检测；根据检测结果和标准曲线，确定待测样品中嘌呤核酸类物质及含量。

11、进一步的，所述步骤(1)中，分别称取鸟苷酸、鸟苷、鸟嘌呤、腺苷酸、腺苷、腺嘌呤、肌苷酸、肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、脱氧腺苷酸、脱氧腺苷、脱氧肌苷酸、脱氧肌苷、脱氧鸟苷酸、脱氧鸟苷1mg，置于5ml的容量瓶中；肌苷酸标准品用超纯水溶解，其余的标准品均使用50μl的naoh(1m)助溶，超纯水填充，最终配置成浓度为1mg/ml的标准储备液。

12、进一步的，所述步骤(2)中，配制两种混合标准品溶液：分别吸取鸟苷酸、肌苷酸、黄嘌呤、脱氧肌苷酸、腺嘌呤、脱氧腺苷、肌苷、脱氧肌苷、脱氧鸟苷、脱氧腺苷酸、鸟苷、腺苷、脱氧腺苷共计12种嘌呤核酸物质标准储备液100μl置于10ml容量瓶中，配制成浓度为100μg/ml的混合标准储备液一，然后用超纯水逐级稀释，配置浓度为50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml的系列浓度梯度混合工作液一；分别精密吸取4种嘌呤物质腺苷酸、次黄嘌呤、脱氧鸟苷酸、鸟嘌呤标准储备液100μl置于10ml容量瓶中，配制成浓度为100μg/ml的混合标准储备液二，最后按照上述梯度浓度稀释成一系列混合工作液二，用于在碱性条件下检测。

13、进一步的，所述步骤(3)、(4)中的色谱条件为：

14、色谱柱采用c18 column，柱温为35℃、进样量为20μl、流速为0.6ml/min、检测波长为260nm，流动相a为：80mmol/l的h3po4/nh4h2po4以100:9(v/v)组成，溶液b：溶液a中加入20％～40％的甲醇；洗脱程序为：0-15min 99％a、1％b；15-30min 75％a、25％b；30-40min75％a、25％b；40-50min 50％a、50％b；50-70min 99％a、1％b。

15、进一步的，所述步骤(3)中，以酸溶液(如0.1m hcl)调节流动相a和b在酸性条件下，ph＝3～5；优选ph＝4.6。

16、进一步的，所述步骤(4)中，以碱溶液(如0.1m naoh或koh)调节流动相a和b为碱性，ph＝9～11；优选ph＝9.4。

17、本发明的优点和有益效果在于：

18、本发明通过调整流动相酸碱性从而将16种嘌呤核酸物质通过两步操作全部分离出来，除能够同时检测16种嘌呤核酸标准品外，还准确测定了待测样品中的16种嘌呤核酸类物质。

19、本发明操作简单、前处理过程简便，检测浓度为0.5-50μg/ml。16种嘌呤核酸物质的日内精密度及日间精密度的相对标准偏差均小于5％，说明该方法具有较好的精密度和准确度；加标回收率在86.2％-119.2％之间，能够用于嘌呤核酸物质种类与含量的检测。

20、本发明具有操作简单、成本低廉、重复性好且检测准确度和精密度高的特点。

技术特征：

1.一种两段式检测16种嘌呤核酸物质的高效液相色谱方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的的高效液相色谱方法，其特征在于，所述步骤（3）和步骤（4）中的色谱条件为：色谱柱采用c18，检测波长为260 nm，流动相a为：80 mmol/l的h3po4/nh4h2po4以100:9 (v/v)组成，溶液b：溶液a中加入20%~40%的甲醇；洗脱程序为：0-15 min 99%a、1%b；15-30 min 75%a、25%b；30-40 min 75%a、25%b；40-50 min 50%a、50%b；50-70 min 99%a、1%b。

3.如权利要求1所述的的高效液相色谱方法，其特征在于，所述步骤（3）中，以酸溶液调节流动相a和b在酸性条件下，ph=3~5。

4.如权利要求4所述的的高效液相色谱方法，其特征在于，所述步骤（3）中，ph调节为4.6。

5.如权利要求1所述的的高效液相色谱方法，其特征在于，所述步骤（4）中，以碱溶液调节流动相a和b为碱性，ph=9~11。

6.如权利要求5所述的的高效液相色谱方法，其特征在于，调节ph为9.4。

技术总结
本发明公开了一种两段式检测16种嘌呤核酸物质的高效液相色谱方法，属于化学检测技术领域。本发明通过调整流动相酸碱性从而将16种嘌呤核酸物质通过两步操作全部分离出来，除能够同时检测16种嘌呤核酸标准品外，还准确测定了待测样品中的16种嘌呤核酸类物质。本发明操作简单、前处理过程简便，检测浓度为0.5‑50μg/mL。16种嘌呤核酸物质的日内精密度及日间精密度的相对标准偏差均小于5%，说明该方法具有较好的精密度和准确度；加标回收率在86.2%‑119.2%之间，能够用于嘌呤核酸物质种类与含量的检测。本发明具有操作简单、成本低廉、重复性好且检测准确度和精密度高的特点。

技术研发人员：董平,段凡,张静
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16