一种HPLC-MS/MS法检测血浆中瑞卢戈利的方法与流程

本发明属于生物医药，尤其涉及一种hplc-ms/ms法检测血浆中瑞卢戈利的方法。

背景技术：

1、瑞卢戈利(relugolix)为促性腺激素释放激素(gnrh)拮抗剂，对下丘脑垂体gnrh受体有选择性的拮抗作用，阻断gnrh的作用。其由日本武田制药与日本aska制药公司联合开发，于2019年1月8日获日本pmda批准上市，商品名为瑞卢戈利用于治疗子宫肌瘤引起的疼痛。由日本武田制药与英国roivant科技制药公司组建成立的英国myovant科学生物制药公司向fda提交上市申请，2020年12月获fda批准上市，商品名为用于治疗前列腺癌。

2、治疗性药物监测及仿制药临床研究时需要测定受试者或患者的血药浓度以研究其药动学行为。为了加速瑞卢戈利的临床应用，需要一种简便、准确、快速、灵敏度高的生物分析方法。目前，liying xing等(an efficient uplc-ms/ms method established todetect relugolixconcentration in rat plasma[j].original research.2022(6)，13：874973.)开发了一种高效的uplc-ms/ms法检测大鼠血浆中瑞卢戈利的浓度的方法，但该法分析灵敏度较低(定量范围为0.7-1000ng/ml)，且该法使用来他替尼作为内标物质，不利于样品分析的准确性。

3、基于现有技术中瑞卢戈利检测存在的问题，需要开发一种前处理操作简单，并兼顾灵敏度、准确度、分析速度的分析方法，以适用于临床研究大批量样本的准确分析。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种hplc-ms/ms法检测血浆中瑞卢戈利的方法。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种hplc-ms/ms法检测血浆中瑞卢戈利的方法，包括以下步骤：

4、(1)预处理：在血浆样品中加入乙腈沉淀蛋白，离心后取上清液，加水稀释后，得供试品；

5、(2)采用hplc-ms/ms检测经过预处理的血浆样品，经内标定量法测定其中瑞卢戈利的含量，其中：

6、色谱条件：

7、色谱柱：zorbax eclipse xdb-c18色谱柱；

8、流动相a：含0.2％甲酸和5mm醋酸铵的水溶液，流动相b：乙腈；

9、梯度洗脱程序：0-0.5min：流动相b为45％；0.5-1.0min：流动相b为45％→85％；1.0-1.5min：流动相b为85％；1.5-1.6min：流动相b为85％→45％；1.6-2.0min：流动相b为45％；

10、柱温：35-45℃；

11、质谱条件：

12、离子源：电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测；喷射电压为5000v；离子源温度为500℃；

13、所述内标物质为瑞卢戈利-d6。

14、在一些实施方式中，向血浆样品中加入内标溶液，经处理得到含内标物质的供试品；所述内标溶液为瑞卢戈利-d6经甲醇溶解后，以乙腈-水(50∶50，v/v)稀释得到。在一些实施方式中，内标溶液的加入量为血浆样品的0.5-2倍，优选为等体积。

15、在一些实施方式中，步骤(1)中，所述血浆样品的体积为30-100μl，优选为40-60μl，例如50μl。在一些实施方式中，血浆样品中瑞卢戈利的含量为0.100-60.0ng/ml。

16、在一些实施方式中，步骤(1)中，供试品中内标物质的含量为1.00-4.00ng/ml，优选为2.00ng/ml。

17、在一些实施方式中，步骤(1)中，血浆样品与乙腈的体积比为1∶(1-5)，优选为1∶(3-5)，例如1∶4。

18、在一些实施方式中，步骤(1)中，离心后取的上清液，经加水稀释后，样品不易挥发，利于样品的保存和检测的准确度；加入的水量为上清液体积的0.5-2倍，优选加水的量与上清液等体积。

19、在一些实施方式中，步骤(2)中，柱温为40℃；流动相流速为0.5ml/min；进样量为5.00μl。

20、在一些实施方式中，步骤(2)的质谱条件中，气体1(gas1)：50psi，气体2(gas2)：50psi，气帘气体(curtain gas)：35psi，碰撞诱导解离：6psi，驻留时间：200ms。

21、在一些实施方式中，步骤(2)的质谱条件中，瑞卢戈利定量分析离子对：m/z624.3→548.2，碰撞能量(ce)：35ev，去簇电压(dp)：100v；瑞卢戈利-d6定量分析离子对：630.3→548.2，碰撞能量(ce)：35ev，去簇电压(dp)：100v。

22、有益效果：

23、1、本发明方法具有预处理操作简便的特点，仅需要一步提取、一步稀释即可进行分析，提取后样本易于保存；且该方法分析速度较快(分析时间仅为2min)，适合大批量临床研究样品分析。

24、2、临床研究中，检测方法的灵敏度的提高可以降低受试者的服药量，增加临床研究的安全性。本发明所述方法灵敏度较高，血浆用量低(血浆用量可以仅为50.0μl)，瑞卢戈利定量下限为0.100ng/ml，检测限经计算为0.00500ng/ml，柱上待测物的量按照稀释倍数12以及进样量5μl计算为0.00208pg。

25、3、本发明线性范围选择合理(线性范围为0.100-60.0ng/ml)，能够更准确地测定低含量的药物浓度。

26、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

技术特征：

1.一种hplc-ms/ms法检测血浆中瑞卢戈利的方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的hplc-ms/ms法检测血浆中瑞卢戈利的方法，其特征在于，向血浆样品中加入内标溶液，经处理得到含内标物质的供试品；

3.根据权利要求2所述的hplc-ms/ms法检测血浆中瑞卢戈利的方法，其特征在于，内标溶液的加入量为血浆样品的0.5-2倍，优选为等体积。

4.根据权利要求1所述的hplc-ms/ms法检测血浆中瑞卢戈利的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述血浆样品的体积为30-100μl，优选为40-60μl；

5.根据权利要求1所述的hplc-ms/ms法检测血浆中瑞卢戈利的方法，其特征在于，步骤(1)中，供试品中内标物质的含量为1.00-4.00ng/ml，优选为2.00ng/ml。

6.根据权利要求1所述的hplc-ms/ms法检测血浆中瑞卢戈利的方法，其特征在于，步骤(1)中，血浆样品与乙腈的体积比为1∶(1-5)，优选为1∶(3-5)。

7.根据权利要求1所述的hplc-ms/ms法检测血浆中瑞卢戈利的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述加水稀释中，加入的水量为上清液体积的0.5-2倍，优选加水的量与上清液等体积。

8.根据权利要求1所述的hplc-ms/ms法检测血浆中瑞卢戈利的方法，其特征在于，步骤(2)中，柱温为40℃；流动相流速为0.5ml/min；进样量为5.00μl。

9.根据权利要求1所述的hplc-ms/ms法检测血浆中瑞卢戈利的方法，其特征在于，步骤(2)的质谱条件中，气体1：50psi，气体2：50psi，气帘气体：35psi，碰撞诱导解离：6psi，驻留时间：200ms。

10.根据权利要求1所述的hplc-ms/ms法检测血浆中瑞卢戈利的方法，其特征在于，步骤(2)的质谱条件中，瑞卢戈利定量分析离子对：m/z624.3→548.2，碰撞能量：35ev，去簇电压：100v；瑞卢戈利-d6定量分析离子对：630.3→548.2，碰撞能量：35ev，去簇电压：100v。

技术总结
本发明公开了一种HPLC‑MS/MS法检测血浆中瑞卢戈利的方法。所述方法采用蛋白沉淀法进行预处理；色谱条件采用ZORBAX Eclipse XDB‑C18色谱柱，以含0.2％甲酸和5mM醋酸铵的水溶液和乙腈为流动相，进行梯度洗脱；质谱条件采用电喷雾电离源(ESI)串联质谱，并以瑞卢戈利‑d6为内标进行定量检测。本发明方法操作简便、分析速度快、灵敏度高、线性范围合适，满足临床研究大批量样品分析需求。

技术研发人员：史中杰,陈云辉,姜金方
受保护的技术使用者：苏州方昆医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16