一种基于共聚焦拉曼成像的超灵敏侧向流免疫层析试纸条的制作方法

本发明属于生物分析检测领域，主要涉及一种可用于高精度生物分子免疫检测的、基于共聚焦拉曼成像系统的侧向流免疫层析试纸条。

背景技术：

1、侧向流免疫层析试纸条被认为是一种实时现场诊断工具，可以在没有任何专业技术支持的情况下快速监测目标靶蛋白。硝酸纤维素膜（nc膜）是试纸条中最重要的组成部分。首先，它作为固相载体，通过静电相互作用与抗体中的肽键结合，将初级抗体固定在nc膜上。其次，nc膜利用其多孔结构在毛细管力的作用下向前驱动液体，从而捕获和检测样品中的目标物。目前，胶体金检测试纸条是最传统的方法，使用金纳米颗粒偶联的次级抗体捕获目标物，金纳米颗粒在测试线上（t线）聚集并显示为红色。这种检测方法不需要任何设备和专业技术支持，只需通过视觉观察来判断分析结果，这就导致了该检测方法在灵敏度和定量分析上受到较大的主观等因素的影响。

2、为解决这一问题，各种基于侧向流免疫层析的检测方法被研发出，例如：电化学、荧光、化学发光和拉曼光谱等。其中，拉曼光谱因其可以提供样本独特的分子指纹而备受关注。大多数分子的拉曼信号通常较弱，难以用仪器进行痕量检测。表面增强拉曼克服了拉曼光谱灵敏度不足的缺点，可以获得常规拉曼光谱所不易得到的结构信息。表面拉曼增强是通过将信号分子靠近金属纳米颗粒激发表面等离子体共振造成的，分别包括两个方面：局部电场被集中在金属表面附近的“热点”的电磁增强效果和金属表面与目标分析物之间发生电荷转移的化学增强机理。

3、 在本发明中，我们构建了一个高灵敏度的自制的共聚焦拉曼成像仪。与光谱成像器和高光谱成像器相比，拉曼成像器具有较高的光谱分辨率（通常优于1nm）。共聚焦的特征将使我们能够通过滤除附近非聚焦区域中的干扰信息来实现更高的信噪比。因此，与使用传统拉曼成像器相比，可以实现更好的灵敏度、稳定性和重现性。到目前为止，共聚焦拉曼成像技术在横向流动测试条上的应用还没有被报道。在本文中，我们表明，将我们自制的共聚焦拉曼成像仪和侧向流免疫层析试纸条相结合，可以分别对新冠病毒感染和大肠杆菌o157:h7的生物标志物进行低至pm和104 cfu/ml的目标蛋白浓度的定量检测。与商业化的测试条进行比较，我们的共聚焦拉曼成像分析可以显著提高目标蛋白质的检测水平。此外，拉曼检测设备的小型化对于高灵敏度的实时现场检测具有重要意义。

技术实现思路

1、 本发明提出一种低成本高灵敏度的即时诊断技术，可以在复杂的生物环境中对蛋白质进行快速灵敏的分析，这对传染病的筛查和防御是至关重要的。该平台由新型多层滤纸条过滤系统及涂有金属纳米颗粒和拉曼信号分子的侧向流组件组成，并与共聚焦拉曼成像检测系统相结合进行生物标志物分析。基于拉曼成像的侧向流免疫层析试纸条，包括多滤纸侧向流过滤及液体驱动装置、共聚焦拉曼成像装置。侧向流部件置于塑料外壳中，可以将生物、化学等实验室的基本功能微缩到一个几平方厘米的芯片上，完成样品的预处理、分离、混合、化学反应和检测的一系列步骤；共聚焦拉曼成像装置具有较高的光谱分辨率（通常优于1 nm），使我们能够通过滤除附近非聚焦区域中的干扰信息来实现更高的信噪比，实现更好的灵敏度；将侧向流免疫层析试纸条和共聚焦拉曼成像装置相结合，实现高灵敏度蛋白分析物免疫定量检测。

2、所述的侧向流装置将在环境温度下保持稳定，并支持对样本中的生物标志物进行可靠、增强的检测和量化。液体样本被直接加到过滤试纸上，然后通过毛细管力将含有目标物的条带转移到共聚焦拉曼成像分析仪，用于对样本进行光谱免疫分析。

3、所述的侧向流免疫层析试纸条包含位于加样孔下面的样品过滤及吸收垫，可对液体样本进行分离并净化，并将纯化得到的液体样本以条带的形式转移到sers检测窗口。

4、所述的侧向流免疫层析试纸条使用共聚焦拉曼成像装置进行检测。

5、所述的侧向流免疫层析试纸条中，使用的与检测抗体偶联的标记物，包括有表面拉曼增强效应的纳米粒子，这种纳米粒子可以是组分为金或银或钯的纳米结构，其中包括纳米星、纳米棒、或纳米球；以及与之相偶联的不同类型的拉曼标记物。这种标记物可以是荧光染料，5,5'-二硫代双(（2-硝基苯甲酸）（dtnb），4-巯基苯甲酸（4mba），或罗丹明。

6、所述的基于表面增强拉曼成像的高灵敏度侧向流免疫层析检测装置，可实现样品预处理、洗涤、分离、混合、孵育、免疫反应和检测。

7、本发明的效果：

8、本发明将侧向流免疫层析试纸条和共聚焦拉曼成像装置相结合，利用表面增强拉曼散射的高灵敏性以及共聚焦拉曼成像的快速性特点，实现高精度、定量快速检测。

技术特征：

1.一种基于共聚焦拉曼成像的超灵敏侧向流免疫层析试纸条，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的联检装置，其特征在于：所述的侧向流免疫层析试纸条包含位于加样孔下面的样品过滤及吸收垫，可对液体样本进行分离并净化，并将纯化得到的液体样本以条带的形式转移到sers检测窗口。

3.根据权利要求1所述的联检装置，其特征在于：所述的侧向流免疫层析试纸条使用共聚焦拉曼成像装置进行检测。

4.根据权利要求1所述的联检装置，其特征在于：所述的侧向流免疫层析试纸条中，使用的与检测抗体偶联的标记物，包括有表面拉曼增强效应的纳米粒子，这种纳米粒子可以是组分为金或银或钯的纳米结构，其中包括纳米星、纳米棒、或纳米球；以及与之相偶联的不同类型的拉曼标记物。这种标记物可以是荧光染料，5,5'-二硫代双(（2-硝基苯甲酸）（dtnb），4-巯基苯甲酸（4mba），或罗丹明。

5.根据权利要求1所述的联检装置，其特征在于：所述的基于表面增强拉曼成像的高灵敏度侧向流免疫层析检测装置，可实现样品预处理、洗涤、分离、混合、孵育、免疫反应和检测。

技术总结
本发明公开了一种基于共聚焦拉曼成像的超灵敏侧向流免疫层析试纸条，用于检测生物标志物。金纳米颗粒作为拉曼增长因子，荧光染料作为拉曼信号分子。用自主开发的共聚焦拉曼成像仪对T线上形成的“三明治”夹心复合物进行检测，对大肠杆菌O157:H7的检测限为~1×10<supgt;4</supgt; cfu/mL，对新冠N蛋白的检测限达到~pM。与商业化试纸条相比，该检测限提高了1‑2个数量级，证明金纳米颗粒可以显著增强试纸条上的拉曼强度。由于使用了与商业化试纸条中的不同的抗体对，导致灵敏度不高。该实验主要用于原理论证。整个检测过程可在15分钟内完成。本发明将共焦拉曼成像与侧向流试纸条相结合，实现对目标蛋白的高灵敏度的快速、实时检测，对筛查传染病和检测细菌病原体尤为重要。

技术研发人员：何赛灵,张川,杨安琪,焦长伟
受保护的技术使用者：台州安奇灵智能科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1