猪圆环病毒4型Cap蛋白间接ELISA检测试剂盒、检测方法及应用

本发明涉及生物，具体涉及一种猪圆环病毒4型cap蛋白间接elisa检测试剂盒、检测方法及应用。

背景技术：

1、猪圆环病毒(porcine circovirus，pcv)是迄今已知最小的dna病毒，属于圆环病毒科(circoviridae)圆环病毒属(circovirus)成员之一，单股环状、二十面体对称、无囊膜，基因组大小介于1.7～2.1kb之间。基于pcv基因序列同源性与抗原性的差异，目前已在猪群中鉴定出4种类型的猪圆环病毒：pcv1、pcv2、pcv3和pcv4。研究显示，pcv1对猪群没有致病性；pcv2感染猪后可发生猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus associateddisease，pcvad)，目前仍然是危害养猪业最主要的免疫抑制性病原；pcv3和疾病之间的直接关联性尚存在争论，病猪及健康猪均有pcv3感染。

2、pcv4是2019年中国学者在湖南省患有呼吸道疾病、腹泻和皮炎肾病综合征等病猪体内首次鉴定出的一种与其他pcv核酸同源性很低的新型圆环病毒。研究表明，该病毒基因组全长为1700bp，主要包含两个开放阅读框(open reading frame，orf)：orf1编码位于正链上的复制酶相关蛋白(replicase protein，rep)，orf2编码位于负链上的衣壳蛋白(capsid protein，cap)。cap是pcv4中唯一的结构蛋白，包含有多个b细胞与t细胞表位，且具有良好的免疫原性，可作为开发pcv4疫苗及相关诊断试剂盒的候选蛋白。

3、研究发现，pcv4存在单独和混合2种感染模式。pcv4对猪只的单独感染会引起器官组织(肝、淋巴结、肺脏等)出现明显病理变化，但是临床症状并不明显；pcv4与其他猪源病毒(prrs、pcv2和pedv)混合感染猪只，使猪病确诊更加困难，严重威胁着猪业的健康。由于pcv4病毒目前还不能稳定地进行体外传代培养，病毒的传染性、致病性、宿主范围、存在时间及给我国生猪养殖业带来的经济损失等都还不明确，因此，建立抗原与抗体检测的有效方法，进行pcv4流行病学调查，对于丰富pcv4流行病学数据以及pcv4的早期预警、防控具有重要意义。

4、目前，血清抗体检测仍以elisa为主，其操作简便、特异性强和敏感性高等优势，适用于大批量临床样品的检测。对pcv2和pcv3的研究发现，cap蛋白是pcv2和pcv3的主要免疫相关蛋白，基于cap蛋白建立的elisa方法已被广泛用于pcv2和pcv3的血清学诊断。而关于pcv4 cap蛋白的elisa检测方法鲜有报道。另外，目前市面上尚未开发出pcv4 cap蛋白的elisa商品化抗体检测试剂盒，给pcv4疫苗早期研究的免疫原性评估造成不便。为此，本研究采用大肠杆菌表达系统对pcv4 cap蛋白进行了表达，将纯化的重组cap蛋白作为包被抗原，建立特异性强、敏感性高、简便实用的pcv4间接elisa方法并用于临床检测，以期为评价福建省猪群pcv4感染状况、开发pcv4抗体诊断试剂盒及开展pcv4致病性研究等方面提供了一种科学而有效的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒4型cap蛋白间接elisa检测试剂盒、检测方法及应用。

2、本发明的目的通过下述技术方案实现：

3、一种猪圆环病毒4型cap蛋白间接elisa检测试剂盒，其包括以猪圆环病毒4型重组cap蛋白作为包被抗原的包被酶标板；

4、所述猪圆环病毒4型重组cap蛋白的制备方法为：通过nde i和hindⅲ两个酶切位点，将seq id no.1所示序列的猪圆环病毒4型cap基因克隆到原核表达载体上，构建重组质粒；将重组质粒转化到大肠杆菌dh5α中，得到重组表达菌株；重组表达菌株经iptg诱导，超声破碎、离心，取上清；上清ni-nta亲和层析纯化，得到猪圆环病毒4型重组cap蛋白；所述原核表达载体为pet-30a(+)载体。

5、根据权利要求2所述的猪圆环病毒4型cap蛋白间接elisa检测试剂盒，其特征在于：所述iptg诱导为加入iptg至终浓度为0.5mm，在温度为15℃条件下诱导表达16h。

6、上述一种猪圆环病毒4型cap蛋白间接elisa检测试剂盒还包括阴性血清、阳性血清、酶标抗体、洗涤液、稀释液、包被液、封闭液、显色液、终止液；

7、所述酶标抗体为hrp标记羊抗猪igg，所述洗涤液为ph7.4的0.01mol/l pbst，所述稀释液为ph7.4的0.01mol/l pbst加2％脱脂奶粉，所述包被液为ph9.6的0.05mol/l的磷酸缓冲液，所述封闭液为5％脱脂奶粉，所述显色液为tmb，所述终止液为0.5m h2so4。

8、上述一种猪圆环病毒4型cap蛋白间接elisa检测试剂盒的制备按以下操作进行：包被抗原：将猪圆环病毒4型重组cap蛋白以包被液稀释为1.25μg/ml后加入酶标板中4℃包被过夜，100μl/孔，得包被酶标板；

9、洗涤：弃去包被液并用洗涤液洗涤；

10、封闭：每孔加入200μl封闭液，37℃封闭1h，弃去封闭液并用洗涤液洗涤；

11、孵育一抗：将猪血清与稀释液混匀，稀释度1：200，100μl/孔，37℃孵育60min，弃去并用洗涤液洗涤；

12、孵育二抗：将酶标抗体与稀释液混匀，稀释度1：10000，100μl/孔，37℃孵育30min，弃去并用洗涤液洗涤；

13、显色读数：以100μl/孔加入显色液，37℃显色反应10min后以50μl/孔加入终止液终止反应，在酶标仪上450nm波长下测定od值。

14、本发明的显著优点在于：

15、关于pcv4 cap蛋白的elisa检测方法鲜有报道，目前市面上也尚未开发出pcv4cap蛋白的elisa商品化抗体检测试剂盒，给pcv4疫苗早期研究的免疫原性评估造成不便。为此，本研究采用大肠杆菌表达系统对pcv4 cap蛋白进行了表达，将纯化的重组cap蛋白作为包被抗原，建立特异性强、敏感性高、简便实用的pcv4间接elisa方法并用于临床检测，以期为评价福建省猪群pcv4感染状况、开发pcv4抗体诊断试剂盒及开展pcv4致病性研究等方面提供了一种科学而有效的方法。

技术特征：

1.一种猪圆环病毒4型cap蛋白间接elisa检测试剂盒，其特征在于：包括以猪圆环病毒4型重组cap蛋白作为包被抗原的包被酶标板。

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒4型cap蛋白间接elisa检测试剂盒，其特征在于：所述猪圆环病毒4型重组cap蛋白的制备方法为：通过nde i和hind ⅲ两个酶切位点，将seqid no.1所示序列的猪圆环病毒4型cap基因克隆到原核表达载体上，构建重组质粒；将重组质粒转化到大肠杆菌dh5α中，得到重组表达菌株；重组表达菌株经iptg诱导，超声破碎、离心，取上清；上清ni-nta亲和层析纯化，得到猪圆环病毒4型重组cap蛋白。

3.根据权利要求2所述的猪圆环病毒4型cap蛋白间接elisa检测试剂盒，其特征在于：所述原核表达载体为pet-30a(+)载体。

4.根据权利要求2所述的猪圆环病毒4型cap蛋白间接elisa检测试剂盒，其特征在于：所述iptg诱导为加入iptg至终浓度为0.5 mm，在温度为15℃条件下诱导表达16 h。

5.根据权利要求2所述的猪圆环病毒4型cap蛋白间接elisa检测试剂盒，其特征在于：还包括阴性血清、阳性血清、酶标抗体、洗涤液、稀释液、包被液、封闭液、显色液、终止液。

6.根据权利要求5所述的猪圆环病毒4型cap蛋白间接elisa检测试剂盒，其特征在于：所述酶标抗体为hrp标记羊抗猪igg，所述洗涤液为ph7.4的0.01mol/l pbst，所述稀释液为ph7.4的0.01mol/l pbst加2%脱脂奶粉，所述包被液为ph9.6的0.05mol/l的磷酸缓冲液，所述封闭液为5%脱脂奶粉，所述显色液为tmb，所述终止液为0.5 m h2so4。

7.根据权利要求6所述的猪圆环病毒4型cap蛋白间接elisa检测试剂盒，其特征在于：所述猪圆环病毒4型cap蛋白间接elisa检测试剂盒的制备按以下操作进行：

技术总结
本发明公开了一种猪圆环病毒4型Cap蛋白间接ELISA检测试剂盒、检测方法及应用。所述试剂盒包括以猪圆环病毒4型重组Cap蛋白作为包被抗原的包被酶标板，还包括阴性血清、阳性血清、HRP标记羊抗猪IgG、洗涤液、稀释液、包被液、封闭液、显色液和终止液。所述试剂盒具有特异性强、敏感性高、简便实用的优点，为猪圆环病毒4型的临床检测和致病性研究等方面建立奠定基础。

技术研发人员：陈如敬,吴学敏,严山,车勇良,吴仁杰,陈秋勇,连春红,王隆柏,周伦江
受保护的技术使用者：福建省农业科学院畜牧兽医研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15