一种毛细管蛋白定量分析方法与流程

本发明涉及蛋白定量分析，尤其涉及一种毛细管蛋白定量分析方法。

背景技术：

1、在sds-page或2维电泳之后对蛋白质进行染色对于可视化整体蛋白质群或检查重组蛋白质的表达是必要的。常用的蛋白质染色试剂分为已考马斯亮蓝为代表的有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。

2、考马斯亮蓝是通过非共价相互作用与蛋白质的碱性和疏水残基结合，从暗红色变为深蓝色，来实现蛋白质(通过蛋白质凝胶电泳分离)可视化。又分为经典考马斯和胶体考马斯两种主要类型。经典考马斯的检测下限约为100ng，经典的考马斯蛋白染色方法既便宜又容易，但比银染色灵敏度低得多，这使得低丰度蛋白质的可视化变得困难。由于难以标准化脱色步骤，经典考马斯染色的低重现性也是一个缺点。胶体考马斯的检测限约为10ng，胶体考马斯与经典考马斯蛋白染色相比有几个优点。由于缺少脱色步骤，这些包括比银和经典考马斯染色更高的灵敏度和更高的重现性。然而，胶体考马斯比经典考马斯染色花费更多。

3、银染利用银离子与羧酸基团(天冬氨酸和谷氨酸)、咪唑(组氨酸)、巯基(半胱氨酸)和胺基(赖氨酸)相互作用并结合。银离子能够被还原成金属银，从而呈现棕黑色。来实现蛋白质(通过蛋白质凝胶电泳分离)可视化。银染色可以检测到约1ng的蛋白质，这使得它对于涉及低蛋白质水平的应用非常有用。不仅因为需要多个步骤，还因为使用了几种危险的化学物质(包括硝酸银和甲醛)。此外，凝胶需要在染色后进行显影，以使蛋白质可视化，并且显影所需的时间长度在凝胶之间存在很大差异。其结果是再现性低。银染色还具有狭窄的线性动态范围(染色水平与蛋白质浓度成正比的范围)，使其不太适合量化。

4、蛋白质的染色常用的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法(coomasie brilliant blue，cbb)为代表，在蛋白质分析中常用，但对低丰度蛋白质的显现较差；银染灵敏度虽高，却常与质谱不兼容。

5、大多数荧光染料通过多肽主链或与蛋白质周围的sds外层相互作用而与蛋白质非共价结合，需要专用的荧光光源和成像仪设备进行检测。蛋白质检测灵敏度高，能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵，未被作为常规方法使用。

6、同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题。

7、因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高的蛋白质着色法是蛋白质组研究所需。考马斯亮蓝、银染和荧光染色均需要先做sds-page胶，之后进行电泳，电泳后对整个胶进行染色。在染色过程中，考马斯亮蓝染方法简便，但耗时较长，经改进后可以做到无毒操作。银染步骤繁多，耗时短，但操作过程中有甲醇、甲醛等毒性物的接触。荧光染色需要使用昂贵的染色试剂，且需要荧光光源和成像仪。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种毛细管蛋白定量分析方法，解决现有技术中需要染色、耗时长、成本大的问题。

2、为解决上述技术问题，本发明的目的是通过以下技术方案实现的：提供一种毛细管蛋白定量分析方法，包括以下步骤：

3、(1)通过加样装置将免染胶试剂充满毛细管；所述的免染胶试剂包括卤化物或三卤化物；(2)在毛细管的一端加入蛋白质样品；(3)待毛细管中的免染胶试剂凝固后，电泳进行蛋白分离；(4)蛋白分离后，使用荧光照射毛细管内的蛋白质片段进行荧光检测，实现对蛋白质样品的分析检测。

4、优选的，所述的三卤化物为三氯乙酸、三氯乙醇、氯仿或溴仿，所述的卤化物为氯乙酸和氯乙醇。

5、优选的，所述的卤化物或三卤化物的体积含量占免染胶试剂总体积含量的0.5％。

6、优选的，步骤(1)中所述的免染胶试剂，包括分离胶和浓缩胶，卤化物或三卤化物添加至分离胶中。

7、优选的，所述的浓缩胶包括以下成分：0.57μl 30wt％丙烯酰胺、0.43μl 1.5m三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.2μl 10wt％十二烷基硫酸钠、0.035μl 10wt％过硫酸铵、0.01μl四甲基乙二胺，余量为水。以上的百分数均表示的是质量浓度。

8、优选的，所述的分离胶包括以下成分：8μl 30wt％丙烯酰胺、5μl 1.5m三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.2μl 10wt％十二烷基硫酸钠、0.2μl 10wt％过硫酸铵、0.01μl四甲基乙二胺、余量为水。以上的百分数均表示的是质量浓度。

9、优选的，所述的毛细管内径为0.5mm，容积25ul。

10、优选的，步骤(3)中使用120v的电压进行电泳。

11、优选的，所述荧光的光源为紫外光。

12、优选的，所述的荧光检测具体为，将毛细管放置在紫外照射台上激发，使用aniview拍摄激发曝光图。

13、优选的，在对蛋白质片段进行荧光检测之前，先将毛细管放置在白光板上进行毛细管电泳的明场拍摄。

14、如图1所示，本发明的免染胶试剂的反应机理如下:

15、(1)首先，蛋白质上的色氨酸残基在紫外光的激发下进入激发态；

16、(2)激发态的色氨酸残基释放出一个溶剂化电子；

17、(3)溶剂化电子与卤化物或三卤化物发生反应，形成一个氯化物或溴化物离子，并产生一个二卤甲基自由基；

18、(4)二卤甲基自由基与色氨酸残基发生反应，形成一个醛类产物；

19、(5)醛类产物在紫外光的激发下可以发出荧光。

20、总的来说，蛋白质上的色氨酸残基与卤化物或三卤化物反应的过程涉及激发态色氨酸残基的电子释放、二卤甲基自由基的形成以及醛类产物的生成。通过荧光这一特性可以检测到含有色氨酸残基的蛋白质。

21、本发明提供的一种毛细管蛋白定量分析方法与现有技术相比，其有益效果为：本发明的毛细管蛋白定量分析方法，该法首次采用在毛细管中加入免染胶试剂，本发明只需要少量的免染胶试剂对蛋白质样品进行检测，此外，本发明的免染胶试剂在检测过程中不需要染色，进一步缩短了检测时间，简单快捷，节约成本。

技术特征：

1.一种毛细管蛋白定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的毛细管蛋白定量分析方法，其特征在于，所述的三卤化物为三氯乙酸、三氯乙醇、氯仿或溴仿，所述的卤化物为氯乙酸和氯乙醇。

3.根据权利要求2所述的毛细管蛋白定量分析方法，其特征在于，所述的卤化物或三卤化物的体积含量占免染胶试剂总体积含量的0.5％。

4.根据权利要求3所述的毛细管蛋白定量分析方法，其特征在于，步骤(1)中所述的免染胶试剂，包括分离胶和浓缩胶，卤化物或三卤化物添加至分离胶中。

5.根据权利要求4所述的毛细管蛋白定量分析方法，其特征在于，所述的分离胶包括以下成分：8μl 30wt％丙烯酰胺、5μl 1.5m三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.2μl 10wt％十二烷基硫酸钠、0.2μl 10wt％过硫酸铵、0.01μl四甲基乙二胺，余量为水。

6.根据权利要求5所述的毛细管蛋白定量分析方法，其特征在于，所述的浓缩胶包括以下成分：0.57μl 30wt％丙烯酰胺、0.43μl 1.5m三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.2μl 10wt％十二烷基硫酸钠、0.035μl 10wt％过硫酸铵、0.01μl四甲基乙二胺，余量为水。

7.根据权利要求6所述的毛细管蛋白定量分析方法，其特征在于，所述的毛细管内径为0.5mm，容积25ul。

8.根据权利要求7所述的毛细管蛋白定量分析方法，其特征在于，步骤(3)中使用120v的电压进行电泳。

9.根据权利要求8所述的毛细管蛋白定量分析方法，其特征在于，所述荧光的光源为紫外光。

10.根据权利要求9所述的毛细管蛋白定量分析方法，其特征在于，所述的荧光检测具体为，将毛细管放置在紫外照射台上激发，使用aniview拍摄激发曝光图。

技术总结
本发明公开了一种毛细管蛋白定量分析方法，包括以下步骤：(1)通过加样装置将免染胶试剂充满毛细管；所述的免染胶试剂包括卤化物或三卤化物；(2)在毛细管的一端加入蛋白质样品；(3)待毛细管中的免染胶试剂凝固后，电泳进行蛋白分离；(4)蛋白分离后，使用荧光照射毛细管内的蛋白质片段进行荧光检测，实现对蛋白质样品的分析检测。本发明的毛细管蛋白定量分析方法，该法首次采用在毛细管中加入免染胶试剂，本发明只需要少量的免染胶试剂对蛋白质样品进行检测，此外，本发明的免染胶试剂在检测过程中不需要染色，进一步缩短了检测时间，简单快捷，节约成本。

技术研发人员：王卫伟,伍盛鋆,王立世
受保护的技术使用者：广州博鹭腾生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15