一种重组人源化胶原蛋白含量测定方法与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种重组人源化胶原蛋白含量测定方法。

背景技术：

1、透明质酸的结构单元为d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺组成的双糖，存在于包括皮肤在内的大多数软结缔组织中，具有极强的保水性能。随着人们年龄的增长和环境因素的影响，人体合成透明质酸的能力逐渐下降，皮肤中透明质酸的含量会逐渐降低。因此，补充皮肤流失的透明质酸已成为皮肤补水，营养、改善肤质的重要皮肤护理手段。

2、胶原蛋白是细胞间质重要成分，能够增强肌肤弹性、增强机体皮肤组织细胞储水能力，并具备保持皮肤细嫩、柔软的作用。皮肤中的胶原以i型和iii型为主，它有很强的抗张性，儿童的皮肤以iii型为主，到了成年，皮肤以i型为主，随着年龄增长，胶原纤维越来越紧密，皮肤容易老化变僵硬。胶原蛋白由于与皮肤结构相似，具有良好的渗透性，可被皮肤吸收，填充在皮肤基质之间，使皮肤丰满，皱纹舒展，具有弹性。

3、结合透明质酸钠、胶原蛋白在皮肤中的功能优势，透明质酸钠/胶原蛋白复合制剂成为热点并被大量研究开发，尤其是透明质酸钠/胶原蛋白复合溶液被重点关注。

4、透明质酸钠/胶原蛋白复合溶液中，主要成分为透明质酸钠和重组人源化胶原蛋白。yy/t1849-2022及yy/t1888-2023标准中重组人源胶原蛋白含量检测的方法主要有凯氏定氮法和特征多肽法(高效液相色谱-质谱法测定)；而目前报道的动物源胶原蛋白含量测定的方法常见的有氨基酸分析仪、高效液相色谱、高效液相色谱-质谱测定特异性羟脯氨酸的方法。

5、透明质酸钠/胶原蛋白复合溶液中，因含有透明质酸钠和重组人源化胶原蛋白，这二者皆为含氮化合物，溶液体系相对复杂，且无法简单对两种成分进行分离，透明质酸钠的存在对采用凯氏定氮法测定重组人源化胶原蛋含量存在干扰，无法准确定量。参考部分文献及专利(专利公布号cn109481335a)的方法，重组人源胶原蛋白液体制剂直接高效液相(sec色谱柱)分离检测的方法，但是sec色谱柱针对透明质酸钠/重组人源化胶原蛋白复合溶液不能有效的分离并检测。特征多肽法，高效液相色谱-质谱仪器昂贵，增加了分析成本，限制了其广泛应用；动物源胶原蛋白特异性羟脯氨酸法应用于重组人源化胶原蛋白的含量测定检测试剂昂贵，分析成本很高。

6、因此亟需提供一种样品无需经过水解和衍生前处理，操作步骤简单、快速、成本低的检测透明质酸钠/重组人源化胶原蛋白复合溶液中重组人源化胶原蛋白含量的方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种测定透明质酸钠/重组人源化胶原蛋白复合溶液中重组人源化胶原蛋白含量的方法，包括以下步骤：

2、(1)配制多个浓度的重组人源化胶原蛋白标准溶液，通过高效液相色谱法检测不同浓度的重组人源化胶原蛋白标准溶液的峰面积，并绘制成峰面积-重组人源化胶原蛋白浓度的标准曲线；

3、(2)将透明质酸钠和重组人源化胶原蛋白的复合溶液用超纯水稀释得到待测溶液；

4、(3)通过高效液相色谱法检测所述待测溶液的峰面积，根据所述峰面积以及重组人源化胶原蛋白溶液的标准曲线计算透明质酸钠/重组人源化胶原蛋白复合溶液中重组人源化胶原蛋白的含量。

5、其中步骤(1)和步骤(3)中的高效液相色谱法的色谱条件包括：色谱柱为ultimatexb-c4，规格为4.6×250mm、5μm，流动相由流动相a和流动相b组成，流动相a为0.1％三氟乙酸水溶液，流动相b为乙腈，采用梯度洗脱：起始，流动相a与流动相b体积比为19:1，维持3min。第3min-13min，流动相a与流动相b体积比为4:1，维持2min。第15min-16min，流动相a与流动相b体积比为19:1，维持14min。

6、优选地，所述步骤(1)中重组人源化胶原蛋白标准溶液的系列浓度为0.2mg/ml,0.25mg/ml,0.4mg/ml,0.5mg/ml和1mg/ml。

7、优选地，所述步骤(2)中透明质酸钠和重组人源化胶原蛋白的复合溶液与超纯水的体积比为1:4-19。

8、优选地，所述色谱条件中检测波长为215-280nm，优选为220nm。

9、优选地，所述色谱条件中流速为0.8-1.2ml/min，优选为1ml/min。

10、优选地，所述色谱条件中柱温为30℃。

11、优选地，所述色谱条件中进样体积为40-50μl，优选为50μl。

12、本发明的有益效果：本发明提供的高效液相色谱法(c4硅胶色谱柱)测定透明质酸钠/重组人源化胶原蛋白复合溶液中重组人源化胶原蛋白含量的方法，选用ultimate xb-c4色谱柱，选用0.1％三氟乙酸水作为水相流动相，乙腈作为有机相流动相，提高了检测效率及检测灵敏度；通过优化梯度洗脱以及优化柱温改善了重组人源化胶原蛋白的分离效果。

技术特征：

1.一种透明质酸钠/重组人源化胶原蛋白复合溶液中重组人源化胶原蛋白含量的测定方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(1)中重组人源化胶原蛋白标准溶液的系列浓度为0.2mg/ml,0.25mg/ml,0.4mg/ml,0.5mg/ml和1mg/ml。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(2)中透明质酸钠和重组人源化胶原蛋白的复合溶液与超纯水的体积比为1:4-19。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述色谱条件中检测波长为215-280nm，优选为220nm。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述色谱条件中流速为0.8-1.2ml/min，优选为1ml/min。

6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述色谱条件中柱温为30℃。

7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述色谱条件中进样体积为40-50μl，优选为50μl。

技术总结
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种重组人源化胶原蛋白含量测定方法。本发明方法首先采用高效液相色谱法测定系列浓度重组人源化胶原蛋白标准溶液的峰面积，得出峰面积‑重组人源化胶原蛋白浓度的标准曲线，然后通过高效液相色谱法检测透明质酸钠/重组人源化胶原蛋白复合溶液的峰面积，根据所述峰面积以及重组人源化胶原蛋白溶液的标准曲线计算透明质酸钠/重组人源化胶原蛋白复合溶液中重组人源化胶原蛋白的含量。该方法无需样品经过水解或衍生前处理，操作步骤简单、快速、成本低，分离效果好，检测精密度和准确度高，具有广泛的应用前景。

技术研发人员：李林,王玲昀
受保护的技术使用者：南京思元医疗技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15